外泌体具有神经保护作用！小胶质细胞来源的外泌体使小鼠大脑免受缺血再灌注损伤

小胶质细胞（microglia）是神经胶质细胞的一种，是中枢神经系统中的第一道也是最主要的一道免疫防线。中风引起的脑损伤会激活小胶质细胞，使小胶质细胞极化为M1型和M2型。M1小胶质细胞可以产生高水平的促炎细胞因子，加剧急性脑损伤，而M2型表现出对大脑具有神经保护作用，改善中风后的症状。然而，M2小胶质细胞介导神经保护的潜在机制仍不清楚。有文献表明，间充质干细胞来源的外泌体有利于缺血性卒中后神经元的重塑和功能恢复，还有小胶质细胞来源的微囊泡有调节神经元兴奋性的报道等。

2019年5月4日，上海交通大学医学院附属瑞金医院神经科、Med-X研究院神经科学与神经工程中心的杨国源课题组在《Theranostics》杂志上发表了重要工作[1]，文中阐述M2 BV2来源的外泌体（M2-EXO）通过将miR-124转移到神经元并调控其相应的下游基因，在缺血小鼠大脑中发挥神经保护作用。

实验结果：

1、M2 BV2条件培养基保护神经元存活

为了研究M2 BV2来源的外泌体是否具有神经保护的作用，BV2细胞首先通过加入20ng/ml IL-4被极化为M2型， 极化后明显增加了M2 BV2标志物ARG和CD206的表达水平。如Figures 1A和1B所示，M2条件培养基显著降低了oxygen-glucose deprivation（OGD）处理后神经元的凋亡，提高了神经元的存活能力，而在条件培养基中添加GW4869（一种减少外泌体分泌的小分子抑制剂）后，其保护作用被部分逆转了，表明M2 BV2细胞分泌的外泌体参与了OGD后的神经保护。为了量化M2 BV2条件培养基对OGD处理的神经元的保护作用，作者用乳酸脱氢酶（LDH）方法快速测定细胞活力。实验结果显示，OGD处理使细胞损伤相比对照组增加了6.5倍，同时添加条件培养基使细胞死亡减少到对照组的3倍。值得注意的是，GW4869逆转了M2小胶质细胞条件培养基起的保护作用（Figure 1C）。

M2 BV2细胞分泌的外泌体通过超速离心进行分离，并用TEM、NTA和WB进行鉴定。如Figure 1D所示，外泌体能观察到典型杯状膜泡形态，且颗粒大小在30-120nm范围。WB分析显示，CD9、TSG101、CD63等外泌体标志物均在外泌体中表达（Figure 1E）。

Figure 1 M2小胶质细胞条件培养基保护神经元存活和M2-EXO鉴定

2、M2-EXO在体外和体内均能降低神经细胞凋亡

为了检测M2-EXO能否被神经元摄取，将M2-EXO与神经元共培养24h。共聚焦图像显示，PKH26标记的外泌体（红色）定位于MAP2⁺神经元的细胞质中（绿色），这揭示了外泌体能被神经元所摄取（Figure 2A）。为了探讨M2-EXO在神经保护中的作用，作者将原代神经元与M2-EXO共培养24h，以获得更多的外泌体吸收，并用OGD处理了45min。充氧12h后，M2-EXO处理能显著提高细胞存活率和降低神经元凋亡，这用神经元存活率、TUNEL染色和LDH检测的数据可以得出（Figure 2B-2D）。

随后作者研究了M2-EXO对缺血小鼠的影响。PKH26标记的外泌体在注射3天后的缺血小鼠大脑中检测到，且观察到外泌体位于神经元的细胞质中（Figure 2F）。随后，与PBS处理组相比，M2-EXO处理组能显著减轻卒中后3天的神经行为缺陷（Figure 2G）和降低tMACO术后3天的梗死面积（Figure 2H和2I）。此外，M2-EXO处理组的神经元凋亡数量减少（Figure 2K）。

Figure 2 M2-EXO可减轻脑卒中后神经元凋亡和促进神经行为恢复

3、外泌体miR-124参与了神经保护作用

为了探究M2-EXO介导的神经保护作用机制，作者检测了神经元中几种与神经保护相关的miRNA，包括miR-9、miR-124和miR-132。实验结果显示，M2-EXO处理后神经元中只有miR-124有明显上调，而miR-9和miR-132的表达在体外所有组之间是相当的（Figure 3A）。

接下来，作者通过敲低M2-EXO中的miR-124来验证其潜在机制。感染携带有miR-124-shRNA的慢病毒不仅下调了M2-EXO中miR-124的表达（miR-124k/d-EXO），也下调了用miR-124k/d-EXO处理的神经元中miR-124的表达（Figure 3B）。在M2-EXO处理组中，Cleaved-caspase 3表达降低。miR-124k/d-EXO可以部分挽救其表达（Figure 3C）。如Figure 3D所示，miR-124k/d-EXO处理组的LDH水平高于M2-EXO处理组。在M2-EXO处理组中，TUNE阳性细胞数降低，miR-124k/d M2-EXO挽救的凋亡细胞数比M2-EXO组减少，而miR-cn EXO组显示与M2-EXO组相似的结果（Figure 3E）。因此，作者总结出，M2-EXO能减少由OGD引起的神经元凋亡且miR-124在神经保护中起到了重要的作用。

Figure 3 M2-EXO处理可以通过miR-124保护神经元存活

4、M2-EXO中的miR-124通过调节其下游靶蛋白USP14，提高了神经元的存活率

为了研究miR-124介导的神经保护作用机制，作者从miRBase中测定了几个与神经保护相关的miR-124靶点的表达。在用M2-EXO处理的培养神经元中检测ROCK、SRGAP1、MAPK14、USP14、CREB和Co-REST的表达（Figure 4A-4F）。实验结果表明，用M2-EXO处理显著降低了ROCK和USP14的表达，双萤光素酶实验进一步验证了USP14是miR-124的直接靶点（Figure 4G，4H）。

Figure 4 miR-124推测靶点的表达检测

5、M2-EXO中的miR-124通过下调USP14减轻卒中后小鼠的神经功能缺损和神经元凋亡

为了研究M2-EXO是否通过miR-124及其下游靶点USP14对缺血小鼠大脑的神经保护作用，作者在卒中小鼠模型中注射miR-124k/d-EXO和USP14的抑制剂IU1。IU1处理能明显下调神经元中USP14的表达。如图Figure 5A所示，M2-EXO处理可以大量减少缺血后3天的梗死面积。注射miR-124k/d-EXO外泌体可部分增加梗死面积，而添加IU1后能显著降低梗死面积，其大小与M2-EXO处理组相当。采用神经学评分法，探讨M2-EXO对脑卒中后神经功能缺损的影响（Figure 5B）。在卒中后第三天，M2-EXO处理能显著减轻神经行为障碍，添加IU1可明显改善神经学结果。作者分别在以下处理组中检测USP14的表达水平，即PBS组、M2-EXO组、miR-124k/d EXO组、miR-124k/d EXO + IU1组、miR-cn EXO组。实验结果表明，PBS组USP14表达水平较高，而M2-EXO处理组USP14表达降低。miR-124k/d EXO + IU1处理组显示出由于miR-124下调导致了USP14表达显著降低（Figure 5C）。使用TUNEL染色和WB分析验证了M2-EXO在体内的神经保护作用。如图Figure 5D所示，WB结果显示，用M2-EXO处理和miR-124k/d EXO + IU1处理均明显降低了cleaved caspase-3的表达水平。与用PBS或miR-124k / d-EXO处理相比，用M2-EXO处理导致凋亡神经元显著减少（p <0.05），并且miR-124k / d-EXO+IU1处理也明显减少凋亡神经元的数量（Figure 5E）。

Figure 5 M2-EXO处理通过下调USP14表达促进神经元存活

结论

M2-EXO可以通过miR-124及其下游靶点USP14减轻缺血性脑损伤并促进神经元存活。作者推测M2-EXO可能是治疗缺血性卒中的潜在治疗靶点，并且可能部分与miR-124和IU1相关。

参考文献：

[1] Song Y, et al. M2 microglia-derived exosomes protect the mouse brain from ischemia-reperfusion injury via exosomal miR-124. Theranostics. 2019 May 4;9(10):2910-2923.

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