今天早上刷爆朋友圈的Cell paper到底有什么重要发现？难度在哪里？《Cell丨中国学者首次报道人类早期胚胎发育染色质调控的动态图谱——附三组专家点评》（文中蓝色字都带链接）
当初Sun Yi和Xie Wei的paper都是小鼠，这次是人啊！！！对比人和小鼠，有了重要发现：“OCT4基因是人类胚胎合子期基因组激活必须的，但是在小鼠胚胎发育中则不必须。——岳峰”
小伙伴儿最关心的是：有什么思路或方法，能用到我的课题中？读原文找答案：
Graph Abstract
2-cell，只有少量DHS；4-cell，DHS增多；8-cell，合子基因组转录激活（ZGA），出现更多的DHS；
人合子基因组激活时的DHS区域，富集了OCT4的motif；
进化上较老的基因会更早地建立DHS；
DHSs在转座子区域也是逐渐增加的状态，这些转座子有物种特异性。
思路（敲黑板！1、2条对小伙伴有很大借鉴作用）
先宏观，对比各发育阶段基因组范围DHS的数量变化。通常转录因子结合DNA，核小体结构打开；做DNase-seq实验时，这附近的DNA更容易被DNase切到，测序后就能观察到峰，定义为DHS。反推，DHS的出现预示着有转录因子结合，预示着基因转录激活；DHS数量增加预示着更多基因转录。（Figure 1）
人们已经知道8细胞期合子基因组激活，这与本文观察到的DHS数量在8细胞期大量增加相吻合。那么到底是不是这样呢？别人已经做过这一时期的RNA-seq，直接拿来用；发现启动子有DHS的基因表达量高，反之亦然。大量转录出来的基因是谁呢？都是非常非常重要的调控和发育相关基因，例如HOX家族。（Figure 2）
寻找关键转录因子。DHS预示着有转录因子结合，那么8细胞期突然增多的DHS，上面结合的是哪些转录因子呢？之前发现OCT4对斑马鱼的合子基因组激活起重要作用，人是不是这样，还不知道。于是，作者对大量涌现的DHS位点进行motif富集分析，发现8细胞期的DHS上确实富集了OCT4。（Figure S5）
这么少的细胞量，作者无法做OCT4的ChIP-seq来验证OCT确实结合在这些DHS上。如果换做其他细胞类型，审稿人会要求补ChIP实验。
只证实OCT4结合还不够，要进一步确认结合在这里的OCT4对转录的影响。有对比才有发现。作者敲降了OCT4，做RNA-seq，跟野生型对比发现，OCT的敲降导致1/4的基因下调表达，推测这些基因的转录依赖于OCT4。再跟8细胞期启动子上有DHS的基因取交集发现，依赖于OCT4的基因当中，85%的基因在8细胞期启动子区都出现了DHS。表明这些基因启动子区出现的DHS跟合子基因组激活期的OCT4转录调控有关。小鼠的情况就不同了，不但OCT4 motif的没有富集，敲降OCT4也没有带来大量基因表达量变化（仅1.4%）。（Figure 3A，B，C）
8细胞期的DHS上的也富集了SOX2的motif（Figure S5）。采用跟OCT4类似的方法，探讨SOX2在合子基因组激活中的转录调控作用，发现敲降SOX2后下调的基因中有161/200与敲降OCT4后下调的基因重叠；并且前面已经看到敲降OCT4后SOX2也下调表达，因此，其实SOX2就是OCT4下游的靶基因，起关键调控做用的依然是OCT4。（Figure 3D，E）
对于小伙伴儿来说，找到了关键转录因子，就可以联系基因功能，做动物实验，在体内验证调控机制。
对于本文来讲，第一次做出人的染色质开放图谱，就要全方位彻底把规律都挖出来。因此，就有了下面的DNA甲基化、转座子和进化的研究内容。
哺乳动物胚胎中会发生DNA甲基化重编程，因此作者借助已发表的DNA甲基化数据，调查了DNA甲基化和DHS的关系。发现启动子上有DHS的比没有DHS的基因甲基化水平更低。DHS区的去甲基化水平高于非DHS区。（Figure 4）
CpG密度与DNA甲基化水平负相关，作者发现有DHS的启动子，去甲基化水平高，CpG密度低，主要是囊胚期参与免疫应答的基因。启动子区CpG密度是否影响了DHS的建立呢？作者发现胚胎发育早期建立DHS的启动子CpG密度高于晚期建立DHS的启动子。（Figure 5）
DHSs在转座子区域也是逐渐增加的状态，这些转座子有物种特异性。（Figure 6）
当初Sun Yi和Xie Wei的paper都是小鼠，这次是人啊！所以一定要从进化角度好好对比一下，发现进化上较老的基因会更早地建立DHS。（FIgure 7）
技术难点怎么克服？
获得染色质开放数据。DNase-seq，大家都知道它好，能解决关键转录调控问题。然而技术难度超级高，世界上能做好DNase-seq的实验室寥寥无几。2013年Howard Chang发明的ATAC-seq更亲民，需要的细胞量少，50000个细胞就能做。一下子解决了这个瓶颈问题，在领域内掀起研究热潮，甚至有人开发了单细胞ATAC-seq。嘉因生物深知ATAC-seq解决转录调控问题的重要性，在国内率先开展ATAC-seq实验服务。
多种数据整合分析。DNase-seq、RNA-seq、DNA甲基化测序，这么多高通量实验，要花多少银子啊？！作者只产生了DNase-seq数据，其他数据都是用前人已发表的。公共数据库里已经积累了海量的高通量测序数据，小伙伴们用力挖吧！再举个例子：《ATAC-seq能干啥？看这一篇就够了》，整合多种已发表的测序数据，深入挖掘自己的ATAC-seq。
寻找关键转录因子。motif富集分析，用HOMER。嘉因小丫曾写过一系列帖子，解决motif查找问题：去哪找motif、找启动子区的motif、互补链上的motif有意义吗？怎样展示结果？通过motif找哪个转录因子调控我的基因。如果自己搞不定，还可以联系嘉因表观小助手：epigenomics
下面细看结果图和主要结论：
一、DHS与ZGA
人类胚胎发育过程中，DHS是逐步建立起来的；你会观察到
二细胞->四细胞->八细胞->桑椹胚->囊胚，DHS从少到多的显著变化。
Figure 1. DHSs Are Dynamic in Human Early Embryos
DHS的出现跟基因表达一致。启动子上有DHS的基因表达量高，反之亦然。
DHS大量涌现的8细胞期，大量转录激活的基因主要富集在非常重要的调控和发育过程。
例如HOX家族基因，从8细胞期开始转录激活
Figure 2. Chromatin Accessibility Is Associated with Embryo Development
二、ZGA期DHS与OCT4
8细胞期的DHS上的确富集了OCT4
Figure S5. Motif Dynamics, Related to Figure 3
人类合子基因组激活期，1/4基因的转录激活依赖于OCT4，小鼠则不依赖于OCT4。
SOX2是OCT4下游的靶基因，起关键调控做用的还是OCT4
Figure 3. OCT4 Contributes to Human ZGA
三、DHS与DNA甲基化、CpG密度
启动子上有DHS的比没有DHS的基因甲基化水平更低
Figure 4. DHS Is Associated with DNA Methylation
胚胎发育早期建立DHS的启动子CpG密度高于晚期建立DHS的启动子
Figure 5. Low-CpG Promoters Tend to Establish DHSs at Later Embryo Stages
四、ZGA期DHS与转座子
DHSs在转座子区域也是逐渐增加的状态
Figure 6. DHSs in Transposon Elements
五、DHS与进化
进化上较老的基因会更早地建立DHS
Figure 7. Association between Gene Age and Chromatin Accessibility