【成功案例】百迈客小RNA测序助力于结核杆菌抑制自噬而逃逸巨噬细胞吞噬的机理研究
英文题目：microRNA-20a Inhibits Autophagic Process by Targeting ATG7 and ATG16L1 and Favors Mycobacterial Survival in Macrophage Cells
中文题目：microRNA-20a通过靶向ATG7和ATC16L1抑制自噬过程，并且促进巨噬细胞中分枝杆菌的寄生存活
发表期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
影响因子：IF=4.3
合作单位：宁夏医科大学总医院
研究背景
细胞自噬是真核生物细胞内普遍存在的一种自稳机制，它通过溶酶体途径对细胞内受损的蛋白质、细胞器或入侵的病原体进行降解并回收利用。当机体被分枝杆菌感染时，自噬在宿主免疫应答过程中起着重要的防御作用。结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）是世界范围内主要的致死性细菌，可调节自噬反应进而躲避宿主的攻击，从而寄生于巨噬细胞中。miRNA在转录后调控中起着关键的精细调控作用。最近，越来越多的研究表明miRNA通过调节ATG（autophagy-related proteins，自噬相关蛋白）或其他调节蛋白，而在自噬中发挥一定作用，尤其在癌症中。然而在结核杆菌感染期间，miRNA是否特异性地影响巨噬细胞的自噬激活在很大程度上是未知的。本研究可以帮助我们对更深入的理解结核分枝杆菌感染相关疾病的发病机理。
NGS实验方法
测序样本：小鼠巨噬细胞（RAW264.7细胞）
实验分组：细胞自噬抑制剂5 mM的 三甲基腺嘌呤（3-MA ）处理、自噬诱导剂50 µg/ml 的雷帕霉素（Rapa ）处理作为实验组，未作处理的细胞系为对照组
小RNA测序：Illumina平台SE 50bp
研究结果
1. 小RNA测序——数据挖掘
关键调控miRNA初筛
作者首先分析了处理组与对照组的差异表达miRNA，在本研究中共找到90个显著性差异表达的miRNA。基于差异表达的miRNA进行聚类热图分析，如下图所示：
进一步分析这些差异表达的miRNA，相比于对照组，其中的52个为差异表达倍数较大的miRNA，即表达量上调差异倍数在1.5倍以上或表达量下调差异倍数在2倍以上，如下图：
已有研究表明，miRNA-19-92基因簇（包含miRNA-20a）在其他细胞模型中参与了自噬调控，提示该基因簇中的miRNA可能也参与巨噬细胞的自噬调控。其中miRNA-20a在自噬抑制剂3-MA组下调，在自噬诱导剂Rapa组上调，可能就是与巨噬细胞自噬相关的关键调控miRNA。
miRNA靶基因预测
通过4款软件（miRWalk、miRDB、miRanda和Targetscan ）进行靶基因预测。共获得432个miRNA-20a潜在的靶标基因，见下图（没有同时做转录组测序，靶基因预测数目较多是正常现象）。看到这里有些同鞋急了，接下来怎么办？不要慌，通过功能注释筛选，GO生物学过程（biological processes）term选择ATG（自噬相关基因），筛选与自噬相关的基因。
共计筛选到19个miRNA和20个靶ATG（自噬相关基因），利用cytoscape软件绘制互作网络，见下图。其中的9个miRNA（miR-20a、miR-152、miR-210、miR-449a、miR-96、miR-182、miR-181a、miR-155和miR-125a）为在本项目中显著差异表达的miRNA，且证实具有特异性靶基因包含于20种ATG中；3个miRNA（miR-30b、miR-144和miR-17）虽没有显著差异表达，但是其已知的特异性靶基因包含于20种ATG内；3个 miRNA (miR-92a、miR-21和miR-19b)为显著差异表达且其潜在靶基因包含于20种ATG内；4个miRNA（miR-10b、miR-19a、miR-18a和miR-29a）差异表达不显著，但其潜在靶基因包含于20种ATG内。对于miRNA-20a，最终只筛选出与自噬相关的2个靶基因：ATG7 和ATG16L1。
2. 表达验证
首先在RAW264.7细胞系中，利用qRT-PCR对miR-17-92基因簇中的miR-17、miR18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a表达量进行验证，miR-17、miR18a和miR-20a在自噬诱导剂Rapa处理组表达量显著上调，但在自噬抑制剂3-MA处理组中只有miR-20a显著表达下调。
分枝结核杆菌弱毒株BCG感染RAW264.7细胞系后，再次利用qPCR技术检测miRNA-20a表达量变化。结果表明，感染后miR-20a表达增加，且具有剂量和时间依赖性。
综上，通过qPCR验证，最终锁定了miRNA-20a为候选miRNA。
3. miRNA-20a靶基因验证
经miRanda 和TargetScan软件分析，发现miRNA-20a与ATG16L1和ATG7基因的3’-UTR结合，见下图。通过转染miRNA-20a mimics过表达miRNA-20a，以及miRNA-20a抑制剂抑制miRNA-20a表达，而后通过实验验证miRNA-20a结合外源性及内源性靶基因ATG16L1和ATG7的3’-UTR而抑制其表达。
miR-20a过表达可抑制含有ATG16L1-WT/ATG7-WT报告基因的293T细胞中萤光素酶活性，但不能抑制含有ATG16L1-Mut/ATG7-Mut报告基因的293T细胞中萤光素酶活性。（ATG16L1-Mut/ATG7-Mut为将miR-20a在其3’-UTR的结合序列进行了定点突变）
miR-20a过表达导致未感染的和分枝结核杆菌弱毒株BCG感染的RAW264.7细胞中ATG16L1和ATG7蛋白表达显著降低，而miR-20a抑制剂处理后则相反。表明miR-20a与内源性表达ATG16L1和ATG7结合抑制其表达。
以上实验表明，miR-20a可以通过与靶基因（ATG16L1和ATG7）3'UTR结合位点直接相互作用来抑制靶基因表达。
4. miRNA-20a抑制巨噬细胞自噬
自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3（LC3）可以作为细胞自噬标记蛋白（LC3在自噬形成过程中发生聚集：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低）。
过表达或抑制miR-20a表达实验：免疫荧光分析结果显示，与对照相比，miR-20a过表达显著减少了BCG感染24小时后RAW264.7细胞中LC3斑点的数目，而miR-20a表达抑制后则相反。
靶基因ATG7敲减实验：无论自噬诱导剂Rapa处理与否，相对于对照组，ATG7 siRNA转染均显著减少了RAW264.7细胞中LC3斑点的数量、ATG7蛋白表达水平和LC3-II / LC3-I（自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II / LC3-I可以估计自噬水平）。同时转染了ATG7 siRNA和miR-20a mimics组，相比于只转染了siRNA组，LC3斑点的数目进一步减少，提示ATG7仅是miR-20a的一个靶基因。
透射电子显微镜/TEM实验：通过TEM检测并定量细胞横切片中的自噬体。miR-20a mimics、ATG7 siRNA、miR-20a mimics+ATG7siRNA转染后显著降低了自噬体的数目，而miR-20a抑制剂处理组则显著升高了自噬体的数目。
以上结果均表明，miR-20a抑制巨噬细胞的自噬作用。
5. miR-20a促进巨噬细胞中BCG存活
使用qPCR检测不同处理组中的分枝结核杆菌弱毒株BCG细菌负荷。用miR-20a mimics或ATG7 siRNA转染显著增加RAW264.7细胞内BCG的细菌载量，而用miR-20a抑制剂转染显著降低细胞内BCG的细菌载量。
以上结果表明，miR-20a通过抑制自噬促进巨噬细胞中BCG的寄生存活，逃逸免疫清除。
小结
miR-20a被分枝杆菌感染诱导表达，抑制ATG7和ATG16L1的蛋白表达，从而抑制自噬反应并促进结核分枝杆菌的潜伏感染和在巨噬细胞的寄生存活（见下方模式图）。本研究揭示了miR-20a在自噬调节中的重要作用，这可以更好地理解结核分枝杆菌免疫清除逃逸并促进发病和持续感染的机制。
参考文献：
Guo L, Zhao J, Qu Y, et al. MicroRNA-20a inhibits autophagic process by targeting ATG7 and ATG16L1 and favors mycobacterial survival in macrophage cells[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology, 2016, 6: 134.