【文献精读】lncRNA测序揭示外泌体lncUEGC1可作为早期胃癌的循环生物标志物

之前与大家分享过几篇外泌体miRNA作为诊断分子标志物的文章，今天小编要和各位分享一篇外泌体lncRNA作为早期胃癌的诊断分子标志物的研究。

研究背景

胃癌（GC）是全球第四大最常见的癌症，也是癌症致死的第二大原因，其早期诊断和治疗可以提高胃癌患者的生存率。而一些胃癌前病变，如幽门螺杆菌（HP）感染、肠上皮化生（IM）和慢性萎缩性胃炎（CAG），增加了现有的无创诊断方法检测早期胃癌（EGC）的难度。

血清或血浆中的循环RNA已成为新型无创诊断的生物标志物，尤其是循环外泌体miRNA已成为早期癌症检测的有效生物标志物。然而，对于在血浆中肿瘤细胞起源的外泌体lncRNA能否有效地诊断早期癌症，目前尚不确定。因此，在这篇文章中，作者旨在确定癌细胞来源的循环外泌体中lncRNA对EGC诊断的潜在价值。

研究方法

• 外泌体分离：I期GC患者 （n = 10）和健康个体（n = 5）的血浆样本，以及人类原发性胃上皮细胞（HPSEC）（n=4）和胃癌细胞（GCC）（n = 4）细胞上清液，分离外泌体；

• 外泌体鉴定：电镜检测、外泌体特异蛋白western blot等；

• 外泌体lncRNA测序；

• 大量样本验证队列进行qPCR验证；

• EGC特异性外泌体lncRNA稳定性分析；

• EGC特异性外泌体lncRNA诊断能力分析。

研究结果

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EGC特异性外泌体lncRNA鉴定筛选

图1为EGC特异性外泌体lncRNA的筛选策略。根据RNA测序数据，相比于健康个体，I期GC患者中有79个外泌体lncRNA和mRNA表达水平上调了2倍以上。已有研究表明，与健康对照组相比，GC患者循环外泌体lncRNA ZFAS1、LINC00152和lncRNA HOTTIP表达水平显著升高；然而，在本试验中上调表达的外泌体lncRNA中，不包含这些lncRNA，可能是因为它们不在EGC中。

在之前的研究中，无法排除这些RNA是由其它细胞分泌的可能性，比如免疫细胞和炎性细胞，它们碰巧出现在原发性组织病变中。因此，这里也通过RNA测序分析了来自4个HPSEC和4个GCC的外泌体RNA。与HPSEC相比，GCC中有285个外泌体lncRNA和mRNA表达上调2倍以上。合并两组结果，发现有6个共有的显著上调基因（图1）。因此，后续研究集中在两个潜在EGC特异外泌体lncRNA，将其命名为lncUEGC1和 lncUEGC2。

图 1

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验证队列中qPCR验证

为了进一步验证RNA-seq数据的准确性，作者使用qPCR对验证队列（EGC样本和GCC）分析外泌体lncUEGC1和lncUEGC2的表达。如图2a和b所示，相对于健康对照组（n=60），I期和II期胃癌患者血浆外泌体lncUEGC1和lncUEGC2的表达水平均显著上调（n=51）。利用12个不同的GCC和来自4个不同健康供体的原代胃上皮细胞培养得到的4个HPSEC细胞上清液进行外泌体富集。qPCR分析结果显示，相比于HPSEC，GCC 外泌体中lncUEGC1和lncUEGC2表达水平显著上调（图2c-d）。总的来说，这些结果与RNA-seq数据一致，说明lncUEGC1和lncUEGC2可能是潜在的可用于早期无创GC诊断的EGC特异性外泌体lncRNA。

图 2

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lncUEGC1和lncUEGC2 稳定性检测

虽然在血浆中循环RNA的鉴定开创了一种新兴的无创诊断领域，但血浆中的大部分lncRNA分子稳定性较差。为了检测lncUEGC1和lncUEGC2在血浆中的稳定性，作者用RNase对20个I期GC样本进行了直接处理。在RNase处理和未处理的血浆中，血浆总循环lncUEGC1的相对血浆水平无显著差异（图2e）。然而，在RNase处理下，血浆总循环lncUEGC2的相对血浆水平下降约2倍（图2f）。超速离心去除外泌体后的血浆上清液中lncUEGC1和lncUEGC2的水平检测结果表明，lncUEGC1在含外泌体血浆中的表达水平高于无外泌体血浆，但lncUEGC2的表达并无显著差异，说明部分lncUEGC2并没有被外泌体包裹。

此外，作者还分析了血浆外泌体RNA与血浆总循环RNA中lncUEGC1和lncUEGC2相对表达水平的相关性。血浆外泌体RNA和血浆总循环RNA中lncUEGC1和lncUEGC2相对表达水平是密切相关的（图2 g-h）。综上所述，上述结果表明，几乎所有的血浆lncUEGC1都包裹在外泌体中，从而避免了RNase的降解，而不是在血浆中自由循环。

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表达模式及诊断准确性验证

为了比较外泌体lncUEGC1和lncUEGC2以及常规肿瘤标志物CEA对EGC的诊断能力，作者检测了血浆外泌体lncUEGC1和lncUEGC2的表达水平和血清CEA水平，来确定它们区分EGC患者和癌前CAG病变患者及健康对照的能力。如图3a～c所示，相对于健康对照组 （n=60），I期和Ⅱ期GC患者（n=23，28）中血浆外泌体lncUEGC1和lncUEGC2相对表达水平和血清CEA水平都显著上调，但只有血浆外泌体lncUEGC1在I期GC患者中的相对表达水平显著高于CAG患者（n=18）。

此外，使用ROC曲线（AUC）来评价诊断特异性和敏感性。血浆外泌体lncUEGC1区分I和II期GC患者（n=51）与健康对照组（n=60）的AUC值为0.8760，而血浆外泌体lncUEGC2的AUC值为0.7582，血清CEA的AUC值为0.6614（图3d）。外泌体lncUEGC1的AUC值明显高于近期EGC诊断研究中血清肿瘤标志物联合检测（CEA、CA19-9、CA72-4和CA12-5）和潜在的血浆miRNA标志物的AUC值。更重要的是，作者的诊断准确性研究中胃癌患者仅限于I期和II期胃癌患者，排除了晚期胃癌患者，这表明lncUEGC1可能比以往不区分阶段的胃癌患者诊断精确性研究中发现的标志物更有说服力。

在区分I期GC患者（n=23）和健康对照组（n=60）方面的试验中也获得了类似的结果，血浆外泌体lncUEGC1（AUC=0.8500）的诊断效率比血浆外泌体lncUEGC2（AUC=0.7486）和血清CEA（AUC=0.6424）更好（图3e）。由于目前的液体活检指标难以区分胃癌早期和癌前病变，作者进一步分析了血浆外泌体lncUEGC1、lncUEGC2和血清CEA区分I期GC患者（n=23）与慢性萎缩性胃炎（CAG）患者（n=18）的ROC曲线。如Fig. 3f所示，血浆外泌体lncUEGC1显示较高的AUC 值（0.8406），而血浆外泌体lncUEGC2的AUC 值为0.6522，血清CEA的AUC值为0.6123。综上所述，这些结果为血浆外泌体lncUEGC1可能作为主要的GC诊断生物标志物提供了证据。此外，此标志物也可有效区分EGC和癌前病变，如GAG。

图 3

结论

此文章是首次使用外泌体lncRNA测序来系统性、彻底性地筛选潜在的EGC生物标志物。本研究揭示了外泌体的独特特性，包括其包裹癌源RNA的能力、在循环系统中的稳定性和可重复检测。EGC起源的外泌体lncUEGC1有望成为具有高度敏感性、稳定性和无创性的EGC诊断生物标志物。

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参考文献：

Ling-Yun Lin, Li Yang, Qiang Zeng, et al. Tumor-originated exosomal lncUEGC1 as a circulating biomarker for early-stage gastric cancer. Molecular Cancer (2018) 17:84.

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