综述│肿瘤“教育”血小板作为癌症检测和进程监测的无创生物标志物来源

对于液体活检，除了ctDNA、CTC和外泌体检测，以及cfRNA，你还知道哪些？今天我们将和大家分享一篇肿瘤血小板RNA检测实现液体活检的综述。

前言

液体活检被认为是癌症早期检测和随后的无创性肿瘤分析和监测有前景的工具。目前，癌症通过临床表现、放射学和生物化学试验来诊断，而对于明确的诊断，通常需要肿瘤组织的病理分析。由于越来越多的癌症筛查试验，例如通过乳房摄影和低剂量计算机断层扫描肺部成像，可以在患者仍无症状的早期阶段检测到肿瘤。此外，临床肿瘤学实践依靠活检切除肿瘤组织以分析与肿瘤相关的遗传改变和其他癌症生物标志物。虽然肿瘤组织活检是当前癌症诊断的金标准，并且是癌症治疗的重要工具，但近年来已经很清楚，从单个活检组织获得的信息提供了肿瘤在空间和时间上有限的快照，并且往往不能反映疾病的异质性。此外，肿瘤活检的侵入性对重复取样造成限制。

几十年来，血液是肿瘤相关生物标记物的丰富来源，包含几种生物标志物来源：

1）单核细胞组分：包括白细胞、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）和循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CEC）；

2）血浆和血清：包括细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）、胞外游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）和游离RNA（cell-free RNA，cfRNA）、血浆蛋白和代谢物以及肿瘤“教育”的血小板（tumor-educated platelets，TEP）。

这些生物分子和生物资源被认为是原发性肿瘤的肿瘤发生和全身性活动的一部分（例如CTC、CEC、EV、cfRNA和TEP），或被认为仅源于肿瘤细胞凋亡和坏死期间的被动释放（例如cfDNA）。研究表明，血液中的每种生物来源和生物分子都有用于血液癌症诊断、伴随诊断、预后和治疗监测的潜力。例如，cfDNA的分析可用于检测点突变、结构变异、拷贝数畸变、差异cfDNA长度和甲基化状态；此外，胞外囊泡EV已被证明拥有不同长度的蛋白质和RNA生物标志物分子，还有与癌症转移的器官特异性相关的表面膜蛋白；TEP被认为是癌症存在的局部和系统性应答，从而隔离EV来源的RNA和蛋白质，以及改变其RNA剪接谱。有趣的是，多种生物资源和生物分子组合，在此以血浆来源的cfDNA和蛋白质组合为例，可检测到62％的I-III期癌症（测试特异性> 99％），并且为早期癌症发现提供了一种创新的方法。

总之，液体活检可实现：（i）癌症早期检测（筛查）；（ii）通过提供关于疾病分期和传播的信息来实现对个体患者的预测；（iii）鉴定用于个性化治疗的新目标；（iv ）治疗前治疗反应的预测；（v）早期治疗反应监测和“实时”评估治疗有效性；（vi）疾病复发早期检测。

TEP对癌症传播的贡献

在过去的十年中，在健康和疾病方面血小板对免疫和炎症活动的贡献度越来越高，包括癌症进展方面。血小板可被视为免疫系统的“扫描士兵”，从而感知细菌进入血液的存在，与淋巴细胞交叉通信，并部分调节免疫细胞外渗。在癌症存在期间，血小板对肿瘤固有的癌细胞以及进入血液的癌细胞有影响。首先，血小板通过向肿瘤提供多种促血管生成因子如VEGF、PDGF和bFGF以及通过刺激这些因子的表达来创造支持新生血管形成的环境。接下来，血小板减少局部肿瘤细胞凋亡和失巢凋亡，并且能够通过直接的物理相互作用和TGFb分子的释放诱导肿瘤细胞中的上皮-间充质转换。随后，血小板保护循环中的肿瘤细胞免受正常免疫应答的能力可能显著促成肿瘤转移过程。然后，血小板围绕CTC或滞留的肿瘤细胞形成细胞-纤维蛋白-血小板聚集，提供机械保护，并将MHC I类蛋白转移至CTC，从而产生针对自然杀伤细胞的额外保护。最近的lab-on-chip微流体芯片分析揭示存在潜在的CTC亚群，其具有增强的血小板覆盖率和可能的血小板介导的保护。激活后，血小板可释放多种生长因子和促血管生成因子，一旦这些因子在转移微生态环境释放，就会形成刺激肿瘤生长微环境。因此，血小板是肿瘤微环境的基本组成部分，并被认为是肿瘤生物学的一个重要方面，因为它们有助于肿瘤发生、进展和治疗反应。每天使用阿司匹林可预防癌症，这一话题已重新引起人们的兴趣，并且是一个长达数十年有争议的话题。阿司匹林既可以抑制肿瘤内在的环氧合酶活性，这可能控制细胞内信号传导途径和局部炎症反应，也可以抑制血小板固有的环氧合酶活性，这将影响血小板活化和聚集等过程。血小板聚集抑制剂，如心脏病学中使用的替格瑞洛、氯吡格雷和普拉格雷，对静脉内和脾内黑素瘤和乳腺癌小鼠模型中的转移扩散产生了抑制作用。此外，这些药物靶向血栓形成必需的受体（例如二磷酸腺苷受体），影响导致癌症进展的机制：主要通过调节肿瘤细胞/血小板相互作用和血管生成。因此，血小板介导肿瘤进展和癌症全身扩散的关键步骤。

TEP可实现基于血液的癌症诊断和治疗监测

研究表明，血小板计数和血小板大小已经可以提供有关癌症存在的临床相关信息。血小板数目高与各种癌症如恶性间皮瘤、妇科恶性肿瘤以及肺癌、肾癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌的死亡率增加有关。事实上，肿瘤衍生的血小板因子4（PF4，CXCL4）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中促进骨髓巨核细胞介导的血小板产生。据报道，治疗前血小板与淋巴细胞比率升高与nivolumab抗PDL1免疫疗法的响应率降低相关，表明循环血小板可在存在抗肿瘤免疫应答的情况下增强肿瘤发生作用。有趣的是，它也表明，血小板可以渗入肿瘤组织，血小板可以连续定殖并从肿瘤微环境中排出。最初研究专注于脑肿瘤的非侵入性诊断，并观察到来自胶质母细胞瘤患者的TEP螯合肿瘤衍生的EGFRvIII突变RNA分子。接下来，证实了来自非小细胞肺癌(NSCLC)或前列腺癌患者的TEP中临床相关生物标志物的摄取。microarray分析显示，与来自健康对照TEP相比，来自胶质母细胞瘤患者的TEP中的一组RNA被改变。转移性NSCLC患者检测到了类似的现象。随后，开发了thromboSeq平台，这是一种基于RNA测序的方法，能够从微量的血小板RNA（100-500 pg，相当于一滴血液中的血小板，使用SMARTer扩增全长cDNA）中识别RNA剪接图谱，并结合复杂的机器学习为基础的分类算法，以对数百个血小板样品的绘制RNA谱并分类（下图）。

这使得研究者能够以84％-96％的准确度区分患有局部和转移癌症的患者与健康个体。此外，研究者能以71％的准确度精确定位原发肿瘤的器官，如果选择了分类算法所指示的第一和第二最佳可疑器官，甚至可达到89％的准确度。此外，鉴定出剪接的RNA突变特征，与肿瘤组织分子亚型相关，例如EGFR和KRAS突变以及HER2和MET扩增，其准确度为85％至95％，尽管分析所用的样品数量相对较低。通过GO分析，发现涉及血小板活性和血小板囊泡的RNA分子富集，涉及RNA维持和剪接的RNA分子减少。这项概念验证（proof of concept）研究之后是一项随访研究，其中包括对年龄匹配的NSCLC队列和炎性疾病患者的进一步分析。该随访研究中，血液和血小板分离之间的时间也被标准化，因为这可能影响血小板RNA谱（Cancer Cell 2017;32:238-52，血液采集后12小时内分离血小板）。另外，解决了生物标志物基因或RNA panel发现研究中臭名昭著的挑战：大量的生物标志物分子集。为克服这一挑战，在训练过程中使用迭代地优化剪接的RNA panel的生物标志物算法——群集智能。这种方法使≥500个样本晚期NSCLC独立验证队列中晚期NSCLC的诊断准确性达到89％，>100的局部晚期NSCLC独立验证队列NSCLCBest中准确率为81％。最近对多发性骨髓瘤患者的分析发现，健康个体与阴燃多发性骨髓瘤患者之间存在差异TEP RNA谱，这表明血小板治疗也发生在血液恶性肿瘤中。

除了癌症筛查之外，TEP还被用于监测癌症进展。 由于TEP可以隔离肿瘤衍生的RNA分子，包括EML4-ALK融合转录本，已表明NSCLC患者有效的克唑替尼抗EML4-ALK治疗降低了循环TEP中EML4-ALK转录本的数量。血小板的寿命大约为7-10天，肿瘤生成的转录物可以积累在TEP中并且被保护免于循环血浆来源RNA酶降解，因此可以预期TEP RNA分析将揭示最新的、增强的和动态反应的肿瘤活性。

可能负责血小板“教育”的生物机制

导致TEP RNA库改变的确切队列（queues）和随后的特定效应仍然未知。目前解释这一现象的假设是基于来自肿瘤及其微环境的外部队列的潜在影响，其导致了血小板内pre-mRNA剪接。总之，癌症患者的血小板具有主动/前摄（proactive）状态的表型，如血小板活化膜标志物（如p-选择素）阈值降低和这些患者群体中血栓栓塞发生率增加。尽管血小板是无核细胞碎片并且无细胞核，但是它们被巨核细胞包裹着，它们的前体细胞存在于骨髓和最近发现的肺中，肺中具有pre-mRNA池、功能性剪接体和蛋白质翻译机器。除了存在（pre-）mRNA外，血小板还含有小的RNAs，包括microRNA（miRNA）、长链非编码RNA、环状RNA（circRNA）和线粒体DNA。与“老”血小板相比，年轻的血小板具有更高的RNA含量，这表明血小板需要巨核细胞提供的RNA在血流中循环或归巢/浸润到原发性肿瘤负荷区域或转移部位。事实上，通过细菌释放的几种刺激物诱导的血小板活化可诱导随后的pre-mRNA剪接和蛋白翻译，例如LPS和葡萄球菌来源的α-毒素。类似地，癌细胞和肿瘤微环境（基质细胞和免疫细胞）释放生物分子可诱导剪接事件，尽管确切的因素和伴随的剪接变化仍然未知。有人提出，剪接事件只能部分解释为选择性剪接事件，剪接事件也可能部分依赖于RNA结合蛋白（RBP）的活性。体外分析显示RBP Clk1 / SRSF1能够剪切组织因子mRNA。同样，假设在50个和30个非翻译区序列中富含RBPs的结合位点（部分负责剪接诱导并与TEP中富集的RNA水平相关），可能导致差异RBP panel，并且RBP结合位点更多剪接也更多。pre-mRNAs的额外调节可以通过microRNAs和其他RNA进行，包括circRNAs环化和去环化。另外，肿瘤衍生的队列（queues）对骨髓和肺驻留巨核细胞及其RNA产生的影响仍不清楚，预期应激的巨核细胞会改变其RNA库。

除了血小板内RNA剪接之外，血小板能够通过例如囊泡介导的运输机制连续地将核酸和蛋白质与其他血小板、免疫细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞进行生理交换。已显示肿瘤相关生物分子被转移到血小板，导致其“教育”（educated）。或者，血小板衍生的微粒穿梭至肿瘤细胞，从而以miRNA依赖性方式调节抗肿瘤和促肿瘤发生基因表达程序。尽管胞外囊泡EV螯合/隔离和内化的确切机制以及血小板是否具有特定大小和类型的囊泡选择机制仍然未知，但螯合蛋白质和核酸（可能还包括cfDNA）的能力似乎是血小板在其整个寿命期间固有的能力。此外，是否存在对生物分子多价螯合更敏感的血小板亚群，例如年轻的网状血小板，其中存储了螯合物质的血小板隔室，以及血小板是否主动翻译隔离的核酸仍然未知。迄今为止，正如通过仅隔离肿瘤特异性突变RNA的少量拷贝数所示，与巨核细胞-遗传的RNA相反，隔离RNA的相对水平仍然较低。因此，响应外部信号的特异性剪接事件和血小板直接摄取（剪接的）循环mRNA的能力，导致血小板具有高度动态的mRNA含量。在癌症患者的TEP中，存在与细胞骨架活化、血小板活化和ATP活性相关的剪接RNA的富集。

除了TEP RNA含量的内部改变之外，癌症患者中的血小板亚群也可能发生变化。血小板在血流中循环约7-10天，之后它们在脾脏中降解。它们不断被骨髓和肺部巨噬细胞释放出来，开始循环的第一天为年轻的、网状的、富含RNA的血小板。在其寿命即将结束时，他们将被去唾液酸化，并通过去唾液酸糖蛋白（Ashwell-Morell）受体促使肝脏产生促血小板生成素以刺激随后产生新血小板。该过程介导血小板形成和分解的连续循环，导致血液中具有多种血小板亚群，例如网状血小板、凝血或“coated”血小板和“老”血小板。由于每个亚群都有其特定的内容物、效果和预期的剩余寿命，因此这一过程对于输血医学血小板的研究，也许还有癌症的研究尤为重要。已经显示，NSCLC可以通过释放PF4来增强血小板生成，之后将血小板招募至肺和肿瘤实质。血小板增多与卵巢癌患者血浆中血小板生成素和IL6水平升高有关。最近对全身性脓毒性休克患者血小板的分析揭示了血小板在肺和脑组织中渗出，在这些组织中释放促炎介质，随后使这些器官留下空的颗粒的潜力。研究已经证明，含有与NSCLC相关的698个RNA的TEP-RNA panel显示出与网状血小板的标志物p-选择素相关的1,820个RNA基因panel的大量重叠（77％）。总之，研究了与非癌症对照相比，从NSCLC患者收集的血小板中富集的总RNA回收率。最近，Clancy和他的同事分析了小的和大的血小板的RNA含量，并在大的血小板中观察到与血小板/囊泡和止血相关的GO富集。这一观察结果支持与之前TEP分析相关的GO结果，表明癌症患者富集的RNA具有相似生物学过程。总而言之，可以假设在癌症患者中，年轻的血小板在血液中越来越多地出现，可能导致血栓形成潜能的增加。或许，网状血小板能够更有效地隔离肿瘤来源的核酸和蛋白质生物标志物，或者为血液生成的CTC提供改善的屏蔽能力。有人提出，较老的、较小的血小板在其寿命期间可能会螯合源自血管细胞的丰富RNA库，表明血小板亚群与特定转录物的富集或消耗相关。对于每种特定的血小板亚群，癌症教育过程效率的进一步确定令人感兴趣。此外，在癌症进展和治疗过程中血小板亚群的变化对于基于血小板的液体活检可能是感兴趣的。此外，“coated”血小板在癌症患者中的贡献和作用可能是有价值的。另外，血小板RNA的异质性可以在单个血小板水平被发现，例如，单血小板RNA测序，尽管技术障碍如具有高度特异性、低活化血小板的分选，和超低RNA起始量测序有待克服。目前确定的和可能未确定的血小板亚群的特定膜标记的鉴定在这个过程中可能是至关重要的。

结束语

血液分析可以使未来能够以高便利性同时筛选多种肿瘤类型。为了早期发现癌症，理想的血液检测具有极高的特异性。以敏感性为代价可以接受高检测特异性，尤其是一旦每年进行这些基于血液的筛选测试。或者，对于高风险患者群体，例如BRCA突变且乳腺癌的终身风险达60％-80％的女性，可以考虑具有高敏感度和中等特异性的基于血液的筛查检测从而确保以检测特异性为代价检测每个早期癌症。开发用于筛查癌症的血液检测需要将患有炎症和其他非癌症疾病的个体作为对照，并且需要考虑实体组织和造血系统中随着年龄而变化的体细胞改变的累积。除检测癌症外，血液检查还需要提供临床后续诊断的线索。研究已经表明，TEP和cfDNA都可以提供关于起源器官的信息，尽管其准确性必须在疑似（早期）癌症的患者的血液中进一步研究和独立验证。此外，根据“检测和选择”的理念，血液为基础的检测为从手术到免疫治疗的最有效的治疗提供指导。可以预计，未来几年将首次实现用于早期癌症检测的基于血液的商业化测试。

为了推进国家早期癌症检测的血液基础筛查计划，未来的临床验证研究需要在（i）大样本队列（> 10,000个测试的个体，如最近鼻咽癌队列）中进行；（ii）良好表征的癌症确诊患者、疑似癌症患者和非癌症对照样本，匹配潜在的混杂变量，如年龄、性别和吸烟状况；（iii）标准化的血液处理和储存条件；（iv）并行解读多种生物资源和生物分子。以这种方式获得的大量数据，可能受到新的生物信息学算法和机器学习软件的影响，可能导致先前血液中未识别的模式指示原发性肿瘤的存在和位置。总之，建议进一步评估并最终大规模验证可用的液体活检生物来源和生物分子，理想情况下以包括TEP RNA库的组合方式进行验证。

附：血小板分离方法

Whole blood samples in 4-, 6-, or 10-mL EDTA-coated Vacutainer tubes were processed using standardized protocols within 48 hours (Best et al., 2015, Nilsson et al., 2011). Whole blood was subjected to platelet isolation within 12 hours after blood collection. Platelet counts were obtained from the clinical records and quantified using the Sysmex XN9000 (Etten-Leur, NL) platelet quantification method. To isolate platelets, platelet rich plasma (PRP) was separated from nucleated blood cells by a 20-minute 120xg centrifugation step, after which the platelets were pelleted by a 20-minute 360xg centrifugation step. Removal of 9/10th of the PRP has to be performed carefully to reduce the risk of contamination of the platelet preparation with nucleated cells, pelleted in the buffy coat.Centrifugations were performed at room temperature. Platelet pellets were carefully resuspended in RNAlater (Thermo Scientific) and after overnight incubation at 4°C frozen at -80°C——Cancer Cell 2017;32:238-52.

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参考文献

BEST, Myron G.; WESSELING, Pieter; WURDINGER, Thomas. Tumor-Educated Platelets as a Noninvasive Biomarker Source for Cancer Detection and Progression Monitoring. Cancer Research, 2018.

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