空间转录组测序技术辅助揭示ALS（肌萎缩性侧索硬化症）疾病发生的时空顺序

期刊：Science

IF:41.845

 本研究提供了一个结合分辨率、复制和生物学干扰，综合时空和转录组基因表达的数据集。从小鼠模型中得出推论，并在临床样本中进行测试，为进一步绘制中枢神经系统及其功能障碍模式提供参考。

研究背景

ALS（肌萎缩性侧索硬化症）是一种进行性神经退行性疾病，由运动神经元变性导致骨骼肌失去神经支配而引起的，其症状通常先在单肢的远端肌肉中表现，会逐渐扩散到全身，最终导致全身瘫痪。前人研究表明运动神经元和胶质细胞之间的信号传递障碍是该疾病的一个关键组成部分，但是在完整的脊髓组织中驱动这些过程的分子事件的时空顺序仍然不清楚。

目前基因表达谱分析技术具有通量低，缺乏空间分辨率等局限性，严重阻碍了对ALS发病和扩散的研究。所以本文采用了空间转录组(ST)的实验方法通过利用DNA探针捕获空间条形码阵列上的聚腺苷化RNA，生成定量转录组RNA-seq数据。这种工作流程不需要特别的设备，不需要预先确定基因，并且它的通量远大于其他空间解决方法。考虑到在研究ALS过程中，固定的脊髓细胞组织和细胞间通讯的重要性，我们认为，需要对驱动疾病发生的基因表达变化进行空间解析，以便了解事件的发生顺序，揭示在疾病发生过程的每个阶段（症状前（P30）、发病期（P70）、症状期（P100）和末期（P120））所涉及的细胞亚群，从而确定触发和维持疾病表型的潜在分子机制。具体研究思路如图1所示：

图1

材料方法

材料： 小鼠：SOD1-G93A (ALS)，SOD1-WT（对照），Atg7 cKO（敲除Atg7基因），7例病人（3例球状症状的ALS患者，4例下肢症状的ALS患者）

主要方法：建立ALS模型鼠、空间转录组、免疫荧光染色、测序、数据分析

研究结果

为研究ALS与运动神经元和胶质细胞之间的关系，作者从驱动疾病发生的基因的表达变化进行了空间转录组分析，从小鼠1200个组织切片中绘制出76000多个SGEMs（空间基因表达测量），从80个人类组织切片中绘制出60000多个SGEMs。通过对每个SGEM在解剖注释区域（AAR）进行标记注释，利用模型对空间和RNA-seq数据进行修正，在冷冻组织切片上定量了小鼠的11138个基因和人的9624个基因。对上述数据进行分析，得到以下实验结果。

1.小鼠ALS空间转录组分析准确性

图2

通过对小鼠冷冻切片进行空间转录组分析，发现与ALS相关的已知基因的表达量发生改变（eg., Matr3, Kif5a, and Pfn1；https://als-st.nygenome.org）。同时通过对在ALS中特定区域的基因的时空表达进行分析，发现这些基因的免疫荧光成像与我们在空间上的分析图以及脊髓横截面的HE染色图具有一致性（图2），表明我们数据的完整性和准确性。

2.Trem2揭示小鼠ALS的时空表达模式

图3

ST分析结果表明，ALS与运动神经元附近的小胶质细胞和星胶质细胞功能相关。为进一步探索ALS的时空表达模式，作者着重研究了与小胶质细胞相关的基因Trem2介导的神经退行性疾病模型机制。研究发现当Trem2和Tyrobp与膜类或脂蛋白复合物接触时会形成一种受体复合物，具有吞噬或调节作用。ST数据分析表明，在小鼠的ALS模型中，Tyrobp表达量上调早于Trem2在腹角等症状中出现。此外，同样是该机制中的基因Lpl和B2m在腹角中表达量会上调(症状前)，而Apoe和Cx3cr1则没有。同时发现Apoe的表达是由Trem2信号驱动的，Apoe本身是Trem2的配体。因此，Apoe和trem2两者是在一个自我调控的通路中起作用，可以触发和维持小胶质细胞的吞噬表型。总的来说， Trem2和Tyrobp介导的信号转导是小胶质细胞疾病相关的早期步骤，揭示了Trem2机制的时空表达模式。

研究还发现几个自噬相关基因的突变与ALS有关。ST分析和IF成像显示，在ALS小鼠模型的脊髓中，参与自噬和内溶酶体系统的基因处于失调状态。通过敲除包括运动神经元(ChAT-Cre +/+ ; Atg7 fl/fl ; SOD1-G93A)在内的胆碱能细胞中的Atg7来消融自噬，可导致ALS小鼠早期症状的出现，但存活时间得到延长。这个操作部分挽救了ALS小鼠的反应性胶质增生。为了研究自噬功能障碍与胶质增生和运动神经元丢失之间的联系，对小鼠进行了处理 (Atg7 cKO)。

3. 细胞类型间的相互作用揭示小鼠ALS的时空表达模式

图4

在已发表的scRNA-seq数据中，许多模块由特定细胞类型中优先表达的基因组成（图4）。我们根据细胞类型的特异性表达，对每个模块中的基因进行分组，得到亚模块。特定细胞类型的亚模块可以显示不同的时空表达模式，这些差异代表了该细胞类型中功能不同的亚群。例如，在整个疾病过程中，代表不同区域性星形细胞亚细胞Prdx6和Gfap或Slc7a10和Bcan。在ALS动物中，随着疾病发生，Prdx6亚模块活性逐渐增强，而Slc7a10亚模块则减弱。有趣的是，ALS动物中Prdx6星形细胞亚模块的疾病相关动力学在Atg7 cKO中得到拯救，而在Slc7a10星形细胞亚模块则没有。因此，我们的空间分析确定了区域性星形胶质细胞群体基因表达的程序特征，表现为不同的、与疾病相关的时空动态，并不同程度的依赖于胆碱能自噬。

除此之外，通过识别反映疾病的跨细胞类型的协同活动，突出了与这些过程相关的不同细胞类型的表达程序(图4)。例如，在ALS的胶质细胞增生的时空动态模式中， Trem2、Tyrobp等小胶质细胞基因表达模式与Lrp1、Gba的模式相关。Trem2亚模块包括许多参与补体级联、Fc受体介导的信号转导和吞噬作用的因子，而Lrp1亚模块包括许多鞘脂类信号转导因子。Trem2和Lrp1亚模块与小胶质module 8.9在时空分布上具有相关性。此外，这些神经胶质和星形胶质细胞亚模块的活性与少突细胞前体(OPC)和成熟少突细胞的活性相关(图4)。值得注意的是，Atg7 cKO小鼠自噬作用的消融，挽救了module8表达的时空模式，证明了Atg7 cKO在这些活动中与module8神经胶质细胞相互作用。总的来说，module8所包含的通路活动揭示了完整组织中早期胶质细胞激活过程中细胞类型之间的信号传导，以及在ALS小鼠模型中维持和传播反应表型的机制。

图5

此外，module1在ALS动物中的时空表达模式与髓鞘形成的晚期缺陷一致。值得注意的是，Atg7 cKO不能挽救这个表达模块的动态。module1中小胶质细胞、星形胶质细胞和少突出胶质细胞表达程序的时空相关性揭示了ALS晚期动物中与轴索病理相关的胶质细胞行为信号机制的协调。综上所述，这些结果显示了如何结合scRNA- seq和ST来说明疾病相关过程。

4. 人类ALS时空动态与小鼠的具有一致性

图6

人类ALS患者与小鼠的数据结果具有一致性。结合先前的数据，我们的分析结果支持了ALS病理的严重程度与症状发病部位的接近度有关的观点----人体组织数据显示，前角的基因表达变异与这种接近程度有关。例如，编码乙酰胆碱酯酶(ACHE)的基因，其活性与ALS中的神经肌肉缺陷有关，在症状出现部位的脊髓节段近缘处表达量降低。通过对人脊髓ST数据进行无偏差共表达分析，结果产生了28个表达模块，部分模块与小鼠共存（图6A）。这些人类表达模块的空间映射模式显示出AAR特征模式，其中一些模式沿腰尾轴变化(图6B)，或在白质和灰质之间存在差异，或与症状发病部位的邻近程度有关。KEGG分析显示，人类表达模块3中含有多种调控途径，包括鞘磷脂、内源性大麻素和WNT信号（图6C）。这一发现结合在小鼠ALS模型中的疾病相关动态和富集鞘磷脂信号通路，都表明了该机制在ALS病理学中的重要性，揭示了ALS的时空动态。事实上，在ALS患者的脊髓和SOD1型ALS的小鼠模型中已经报道了糖脂水平及其代谢的改变。神经脂质信号调节剂已被提出作为治疗ALS的潜在药物，并改善ALS小鼠模型的疾病。

小结

本文通过对空间转录组数据进行分析，详细的说明了多种细胞类型、脊髓区域和疾病阶段中鞘脂信号的传导动态，为设计治疗方法提供机会。此外，我们数据的时空特性也为调节该通路活性的潜在治疗策略提供了建议，具有非常重要的研究意义。

内容：烟雨

排版：市场部

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