没有异戊烷怎么做空间转录组？

各位有做空间转录组想法的伙伴们，还在为买不到易燃易爆的异戊烷犯难吗？还在为异戊烷纯度不够烦恼吗？还在为解决不了异戊烷的问题实验停滞不前吗？今天，百迈客跟大家分享几种空间转录组组织包埋的方法，没有异戊烷也可以冷冻组织哟~

组织不应直接置于液氮中，因为温度差可能会导致组织表面沸腾，从而导致气穴和不均匀的冷冻这可能会破裂并在形态上破坏组织。如果您有异戊烷且纯度足够高的话，还是推荐您用异戊烷进行组织冷冻的，具体方法如下：

a.用异戊烷（足以完全浸没组织）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（与异戊烷相同的高度）以充分接触，孵育 15 分钟。

b.将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表明干燥。

c.标记冷冻模具以标记组织的方向，用预冷的 OCT 填充模具，避免产生气泡。

d.用镊子将组织放入含预冷OCT的模具中，用OCT 覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近。

e.用镊子将模具放到异戊烷中，但不要使异戊烷浸入模具内，直到组织冻结。冷冻时间可根据组织类型和大小而变化。

f.冷冻后，将组织转移到预冷的冷冻管中，然后放在干冰上。

g.将 OCT 包埋的组织块保存在–80℃的密封容器中，以便长期保存，或立即进行冷冻切片

如果您的新鲜样本打算直接进行空间转录组实验，且实验室没有异戊烷的话百迈客在这里给您推荐直接用干冰粉进行组织冷冻包埋，具体方法如下：

a.直接准备干冰粉或用研钵将干冰块研磨成粉

b.将新鲜组织置于培养皿中，用干净的纱布或者纸巾吸干组织周围血水，尽量使组织表明干燥。

c.标记冷冻模具以标记组织的方向，用预冷的 OCT 填充模具，避免产生气泡

d.用镊子将组织放入含预冷OCT的模具中，用OCT 覆盖任何裸露组织的表面，确认没有气泡，尤其是在组织附近。

e.将组织放入干冰粉中，直到组织冻结。此方法冷冻包埋组织较慢，且须在干冰粉上静置一段时间，确保组织冷冻均匀，约需30分钟。

f.冷冻后，将组织转移到预冷的冷冻管中，然后放在干冰上。

g.将 OCT 包埋的组织块保存在–80℃的密封容器中，以便长期保存，或立即进行冷冻切片。

组织冷冻包埋组织的方法就给大家介绍到这里，下面跟大家分享一篇结合空间转录组技术探讨小胶质细胞与脑外伤关系的文章。

空间转录组技术辅助揭示再生小胶质细胞

依赖白介素-6促进大脑修复的机制

英文题目：Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner

中文题目：再生小胶质细胞依赖白介素-6促进大脑修复

发表杂志：cell

影响因子：38.637

研究方法

材料：小鼠大脑

方法：通过药理学或遗传方法诱导小鼠大脑中小胶质细胞的更替，结合空间转录组技术阐述小胶质细胞具有促进修复和减轻脑损伤引起的认知缺陷的功能。

研究背景

小胶质细胞是大脑中最丰富的免疫细胞，在大脑发育、维持和疾病中发挥重要作用。这类细胞虽与外周巨噬细胞亲缘性不高，但在发育早期就存在于大脑中，并通过促进神经细胞的形成、突触连接和凋亡细胞的去除，来促进神经回路的塑造。小胶质细胞被认为在成年大脑中起着类似的生理作用，它们还能对影响中枢神经系统的慢性疾病和急性损伤做出强烈反应，由于小胶质细胞与单核细胞来源的巨噬细胞有许多共同的表型特征，因此阐明它们对中枢神经系统损伤或疾病的作用具有重要意义。然而，小胶质细胞不仅被报道在健康成年大脑中介导学习相关的突触可塑性，而且还在神经炎症和正常老化过程中的病理和认知功能障碍等方面起着关键作用。

具有广泛小胶质细胞活化的慢性非溶解性炎症是外伤性脑损伤的一个重要特征，本文利用这一特性直接探索小胶质细胞在影响神经退行性变和认知功能方面的假定作用。在急性期，已知小胶质细胞对脑损伤释放的损伤相关分子模式作出快速反应，然后以ATP依赖的方式向损伤部位迁移,清除细胞碎片被认为是早期小胶质细胞活化的有利方面，这是伤口愈合过程的关键部分。另一方面，在炎症基因表达和/或吞噬现象出现时，许多脑小胶质细胞在创伤性脑损伤的慢性阶段仍保留激活状态，尽管直接证据不足，这种持续的激活状态通常被认为是有害的。

总的来说，关于小胶质细胞与脑外伤的关系，仍有很大的不确定性。作为继发性炎症病理的驱动因素，它们是否确实恶化了神经系统的预后?它们是否妨碍或支持内源性修复过程，或者可能在损伤过程的不同时间阶段都存在所有类型的过程?本文将通过一个外伤性脑损伤小鼠模型给出以上问题的答案。

研究结果

1. 外伤性脑损伤后，消除小胶质细胞并不能提高认知能力，也不能刺激神经形成

首先通过喂食小鼠集落刺激因子-1受体（CSF-1R）拮抗剂PLX5622 ，使小胶质细胞衰竭，来检查外伤性脑损伤（TBI）后小胶质细胞缺失是否会改变海马依赖任务中的认知结果。用可控皮质撞击造成TBI,在脑外伤前3周开始持续给药PLX5622，可导致大范围的Iba1^pos 、TMEM119^pos细胞的丢失，包括海马区。在脑外伤后的整个实验时间内，海马区保持95%的功能缺失。这些结果与喂食食物的小鼠对照组形成鲜明对比。在脑外伤后的12天内，海马内的Iba1^pos细胞数量是假手术组的5倍。

图1A. 脑外伤后Iba1^pos小胶质细胞的定量研究图

图1B.plx5622处理小鼠术后12天海马内Iba1^pos和TMEM119^pos小胶质细胞(绿色)的丢失

在证实持续使用PLX5622治疗可有效清除脑小胶质细胞后，接下来测试了三种依赖海马功能的行为模式下实验小鼠的认知能力，主要测试实验：活动场所回避(APA)，是一个具有挑战性的空间学习任务，动物被放置在一个旋转的转盘上，并要求通过视觉线索不断改变他们的位置以避免被移动到一个静止的打击区。结果表明在plx5622处理过的小鼠中并没有显著改变运动行为，而无论是否存在小胶质细胞，假手术小鼠很快就学会了避开打击区，因此，在假手术和非假手术条件下，小胶质细胞的药物清除并不影响空间学习结果。在Morris水迷宫和y迷宫任务中也证实了这些结果。

2. 创伤性脑损伤后，小胶质细胞的再生减弱了空间学习障碍

文章通过两种独立且互补的方法验证了这一点，首先，使用遗传模型鼠，小胶质细胞可通过白喉毒素(DT)选择性去除，然后再生（图2）；其次，使用已建立的药理学方法，但用短期而不是持续的PLX5622治疗来诱导小胶质细胞的更替；对照组小鼠只服用玉米油。结果表明在创伤性脑损伤急性期诱导小胶质细胞再生的遗传学和药理学方法都显著改善了活动场所回避（APA）的学习缺陷

图2A.遗传模型鼠在停止注射DT和TBI后 小胶质细胞（红色）的再生

图2B . DT与TBI处理后小胶质细胞数目比较灰色线为对照组

3. 创伤性脑损伤后，再生小胶质细胞刺激功能神经再生

与同龄假手术对照组相比，TBI本身可使遗传模型小鼠的同侧海马内DCX^pos细胞总数减少＞60%。然而令人惊讶的是，遭受TBI12天后，在遗传模型鼠小胶质细胞再生过程中未成熟DCX^pos神经元的总数增加了~2倍（图3C），用溴脱氧尿苷（BrdU）进行的脉冲追踪实验进一步揭示了损伤后新生神经元数量的大量增加，并在小胶质细胞再生的TBI小鼠中存活至第12天（图3D），同时也观察到了海马Tbr2^pos神经元前体的增加和活性，在TBI急性期采用药理学方法诱导小胶质细胞更新时，DCX^pos细胞数量也有类似的增加，在这些条件下也观察到更多的Tbr2^pos神经元前体细胞的存在（图3E）和活性（图3F）。为了完全排除外周效应和/或脱靶效应，直接向模型小鼠海马中注射DT，仅在局部诱导小胶质细胞的再生，再次观察到TBI后小胶质细胞耗竭和再生刺激神经再生。

研究还发现，经历过小胶质细胞耗竭和再生的小鼠的大脑海马组织体积更大（图3G-I）。

值得注意是，小胶质细胞耗竭和再生对神经再生的促进作用被限制在一个狭窄的时间窗内，即损伤后3天内，小胶质细胞在此段时间后的更替并不支持新生神经元的产生和生存能力的增强。

图3C.损伤后12天未成熟 DCX^pos神经元总数的定量 

图3D.损伤后12天TBI后新生未成熟 DCX^posBrdU^pos神经元的定量研究

图3E.损伤后12天中间Tbr2^pos神经元前体细胞的定量

图3F.损伤后12天增殖中间神经元祖细胞(Tbr2^posEdU^pos)的定量

 图3 .对照组（G）和plx5622处理后（H）12天的小鼠海马背侧体积

4. 小胶质细胞再生的神经保护作用依赖IL-6传递信号

在确定了TBI急性期活跃的小胶质细胞再生能刺激功能神经发生后，接下来探索了介导这些效应的可能的信号通路。进一步探索全海马组织匀浆中与IL-6信号相关的基因，发现IL6Ra、IL-6信号转导子(IL6st，也称为gp130 [IL6st/gp130])、信号转导子和转录激活子3 (STAT3)的表达量均随小胶质细胞的再生而增加，本文首先证实再生小胶质细胞确实是增加IL-6表达的关键因素，然后，确定了存在再生小胶质细胞的条件下，海马颗粒细胞是脑外伤后的主要白介素-6来源（图4）。

 图4 .TBI遗传模型小鼠中IL-6的细胞来源及正在进行再生的小胶质细胞

5. 小胶质细胞的再生具有独特的转录特征，可以调节脑外伤后的微环境

比较原始和再生小胶质细胞的转录组时发现大量差异表达的基因，再生的小神经胶质对编码在伤口愈合和修复中有已知作用的蛋白质的基因表现出更高表达量（例如, Emilin2, Fn1, Alcam, and Cspg4），独创性通路分析(IPA)进一步揭示了涉及模式/损伤识别和干扰素信号的典型通路的活性降低(图5A)，此外还反映了再生小胶质细胞的增殖状态。主要的变化是再生细胞的反应性降低和增殖能力增强，这是受损大脑中再生小胶质细胞的基因表达谱与原小胶质细胞的基因表达谱的本质区别，空间转录组学进一步强调了小胶质细胞再生对其局部微环境的影响，具体来说，与星形胶质细胞的神经毒性和/或神经炎症(A1)表型相关的基因受到抑制，在蛋白水平上，通过将这些细胞与A1标记物C3联合染色而得到证实（图5B）。

图5A.基于差异基因表达的12个经典通路的分析图

 图5B.星形胶质细胞C3染色(A1标记)的平均荧光强度

结论

在受到损伤影响的大脑区域中，激活的小胶质细胞的存在不一定对结果和/或认知功能障碍有负面影响，相反，在受损伤后的大脑中，激活的小胶质细胞似乎大多缺乏支持内源性修复过程的能力。然而，在哺乳动物的大脑中和再生生物体如蝾螈和斑马鱼，可以诱导出一种可再生的小胶质细胞表型，炎症信号在其中发挥了关键作用。本文已经发现了IL-6信号通路与这种有益表型相关的关键作用，未来的研究可以进一步确定如何利用小胶质细胞再生的独特表型特征进行治疗。

文：荒慌

排版：市场部

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