单细胞转录组测序的文章已经发表很多了，在不应用就赶不上热度了！

单细胞转录组测序分析揭示了经典霍奇金淋巴瘤的肿瘤微环境中定义疾病的T细胞亚群

期刊：Cancer Discovery   

影响因子：29.497   PMID：31857391

导读作者对22个霍奇金淋巴瘤（cHL）组织和5个反应性淋巴样增生（RLN）组织样本进行了单细胞RNA测序，首次以单细胞分辨率分析了霍奇金淋巴瘤特异性免疫微环境的表型。单细胞表达谱鉴定出一个新的霍奇金淋巴瘤相关的T细胞亚群，抑制受体LAG3显着表达，功能分析确定了LAG3⁺T细胞群体是免疫抑制的介质。作者的发现为TME生物学提供了新颖的见解，并提出了针对霍奇金淋巴瘤的免疫检查点靶向的新方法。

研究背景

霍奇金淋巴瘤的特征是由不同类型的非癌性免疫细胞（例如T细胞，B细胞，嗜酸性粒细胞和巨噬细胞）以及稀有的克隆性恶性霍奇金细胞和Reed-Sternberg（HRS）细胞组成的肿瘤微环境（TME）。免疫检查点抑制剂，例如程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂纳武单抗和派姆单抗，在cHL中显示出显着疗效，总缓解率（ORR）为65-87％，持久缓解约1.5年。作者使用127,786个细胞的scRNA-seq，IHC和成像质量细胞术（IMC）对cHL中的免疫细胞进行了高维和空间分析。可在cHL中鉴定出独特的调节性T细胞样亚型，表达淋巴细胞激活基因3（LAG3⁺T细胞），在正常的反应性淋巴样增生中大多不存在。LAG3⁺T细胞以白介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β）的表达为特征，并证实T细胞具有免疫抑制功能，进一步的分析表明cHL患者组中HRS细胞被LAG3⁺T细胞紧密包围。

材料方法

实验材料：22个霍奇金淋巴瘤组织和5个反应性淋巴样增生组织

实验方法：单细胞转录组测序

研究结果

为了将所有细胞进行分类，使用PhenoGraph进行聚类，鉴定不同细胞种类所特有的高表达基因，最终得到了22种细胞类型，包括4个T细胞簇，2个CD8⁺T细胞簇，6个CD4⁺T细胞簇，7个B细胞簇，1个巨噬细胞簇，1个浆细胞样树突状细胞簇和1个祖细胞簇。大多数免疫细胞表型在cHL和RLN之间表现出重叠，作者观察到某些特定细胞簇中有cHL特有细胞富集。发现与RLN相比，cHL样本中调节性T细胞（Treg）簇显着更高。cHL样品的免疫细胞比例最高的簇（“CD4-C5-Treg”）也表现出相对较高的LAG3和CTLA4表达。相反，RLN样品的免疫细胞比例最高的簇主要是B细胞和CD8⁺T细胞簇。

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 考虑到免疫抑制性微环境对于癌症的重要性及其对生物标志物开发和靶向免疫疗法的影响，作者将分析重点放在了Treg亚群的表征上。cHL最富集的Treg簇CD4-C5-Treg的特征在于LAG3的高表达，此外还有常见的Treg标记，例如IL2RA（CD25）和TNFRSF18（GITR）。但是，其他典型的Treg标记（例如FOXP3）并未在该簇中共表达，表明这些细胞可能表现出1型调节性（Tr1）T细胞表型。CD8⁺T细胞不是表达PD-1和LAG3的主要种群，这表明CD4⁺T细胞对cHL免疫检查点调节至关重要。

在单细胞水平上通过FCM分析共表达模式，大多数LAG3⁺T细胞共表达CTLA4，CTLA4被称为更通用的Treg标记。大多数PD-1⁺T细胞不共表达LAG3。FOXP3⁺T细胞共表达CTLA-4。为了更深入地了解cHL的TME中抑制性受体表达的特征，探索了单个T细胞之间的表达模式。LAG3表达的细胞主要在Treg簇，而PD-1表达的细胞主要在非Treg CD4⁺T细胞簇。为了探索LAG3⁺T细胞的功能作用，接下来应用了扩散图算法，目的是表征CD4⁺T细胞之间的分化状态。

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为了表征cHL中Treg的免疫抑制特征，作者研究了LAG3⁺T细胞的细胞因子表达。在CD4⁺T细胞中，LAG3⁺T细胞与LAG3^-T细胞相比，具有更高的免疫抑制细胞因子IL-10，TGF-β和IFN-β表达。这些特征与1型调节性T细胞的概况一致。综上所述，证明了cHL中LAG3⁺T细胞的抑制表型。假设HRS细胞产生的细胞因子或趋化因子可能会影响cHL中的TME。接下来评估了各种淋巴瘤细胞系上清液转移对体外T细胞扩增的影响。T细胞活化14天后，流式细胞仪分析证实，cHL细胞系上清液和CD4⁺CD25⁺T细胞共培养与弥散性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）上清液和CD4⁺CD25⁺T细胞共培养相比，LAG3的表达水平明显更高。Luminex分析显示，与DLBCL细胞系相比，cHL细胞系上清液导致多种细胞因子和趋化因子的富集，包括TARC / CCL17，TGF-β和IL-6，它们是Treg迁移和分化的增强剂。与scRNA-seq结果一致，与CD4⁺LAG3^-T细胞相比，通过FACS分离的CD4⁺LAG3⁺T细胞分泌的IL-10和TGF-β明显更高。CD4⁺LAG3⁺T细胞在体外共培养时抑制了应答性CD4⁺T细胞的增殖，从而确认了LAG3⁺T细胞的免疫抑制功能。

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接下来，作者想了解LAG3⁺T细胞与恶性HRS细胞之间的空间关系。所有病例的IHC均显示，与RLN相比，cHL TME中LAG3⁺T细胞富集，并且在部分cHL病例中，HRS细胞被LAG3⁺T细胞紧密包围。值得注意的是，我们的单细胞分析显示，与MHC II类阳性cHL病例（n = 16）相比，MHC II类阴性HRS细胞（n = 6）的患者LAG3表达显着更高，但与EBV状态或组织学亚型无关。在CD4-C5-Treg簇细胞中，与MHC II类阳性细胞相比，LAG3被鉴定为MHC II类阴性细胞中上调最多的基因。与MHC-II阳性病例相比，IHC显示MHC-II阴性病例的LAG3⁺T细胞明显增加，而且FOXP3⁺T细胞减少。

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为了进一步研究HRS细胞及其周围细胞之间的空间关系，使用IMC评估了所有cHL研究病例中表面和细胞内标志物的表达，在TME的空间背景下可视化35种蛋白标志物。与IHC分析一致，IMC发现MHC II类阴性cHL病例显示出大量LAG3⁺CD4⁺细胞，而FOXP3⁺CD4⁺细胞。

 作者提出了一个模型，MHC II类阴性HRS细胞（类型1）的免疫抑制微环境高度组织化，部分由CD4⁺LAG3⁺T细胞诱导，而CD4⁺LAG3⁺T细胞又由HRS细胞产生的细胞因子和趋化因子诱导。

 文：吴浩

排版：市场部

参考文献

Aoki T, Chong LC, Takata K, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Disease-Defining T-cell Subsets in the Tumor Microenvironment of Classic Hodgkin Lymphoma. Cancer Discov. 2020;10(3):406-421.

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