英文题目：Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays
中文题目：采用编码微阵列进行植物组织空间转录组的样本制备
发表杂志：Nature Protocols
影响因子：10.419
DOI：10.1038/s41596-018-0046-1
植物和其他多细胞真核生物的发展涉及三个关键过程：形态发生，细胞分化和细胞相互作用。在这些过程中，严格调控的基因差异表达协调了各细胞群、空间组织和集体生长的命运。因此，对空间基因表达模式的详细分析对于阐明植物发育过程中的复杂的调控网络至关重要。然而，由于从组织中纯化单个细胞进行转录谱分析的技术困难，我们对整个生物体内细胞分化机制的认知仍然有限，植物组织细胞内空间基因表达模式亟需探索。 本文阐明了植物生长的复杂过程中需要分析的所有受影响组织的空间基因表达模式。文中详细介绍了在微阵列芯片表面上准备和处理植物组织切片所需要做的调整，特别是关于如何进行组织渗透和移除组织。一旦植物组织被移除，留在芯片上的cDNA-mRNA杂合产物的处理方法与哺乳动物组织实验中获得cDNA的方法是相同的。作者等人通过本文描述的方法获得了拟南芥花序、山杨发育和休眠叶芽、冷杉雌球果的高质量测序文库。样品准备和文库构建的整个流程需要3~4天完成。
与LCM, FACS, INTACT 和 smFISH等已应用于研究植物空间基因表达模式的方法相比，空间转录组学 (ST)技术具有明显的优势。该技术可以应用于任何具有可用基因组或转录组序列的物种（不产生转基因系），多个截面同时处理大幅度提升了技术的可靠度，而且可以直接可视化的研究组织切片中所有基因的表达情况。另外，空间转录组学 (ST)技术目前也存在一定的局限性。首先该技术仍然依赖于基因组或转录组序列信息，可以通过测序得到物种的基因组或转录组序列信息解决；其次该技术可能会受到感兴趣组织部位的木质化水平的影响，这方面与所研究的组织类型有关，本文涉及的方法可成功应用于任何类型的软组织（如幼根、正在发育的芽、胚胎、花序等），针对一些具有次生细胞壁的组织需进一步优化；另外该方法目前还无法做到真正意义上的单细胞的分辨率，目前的分辨率在100um左右，每个spot 都可以看作是一个包含多个细胞信息的微体RNA测序实验，而这些信息是与相应的组织形态相关联的。
由于植物组织含有细胞壁及大量的次生代谢物，标准的空间转录组学实验流程并不适用于植物组织，需要进行大量的调整以获得具有代表性的转录本空间模式。
细胞壁的存在阻碍了两个关键的步骤：转录本扩散到芯片阵列表面，以及cDNA-mRNA杂合物释放前的组织切片降解。作者等人通过多种测试，在不影响基因表达信息的前提下，得到多种的酶的混合物用于水解目标组织中的初生细胞壁的主要组分。细胞壁主要有碳水化合物构成，碳水化合物由相对较少的单体组成，并非所有的物种的细胞壁都有完全相同的化学组分和结构。此外，在植物的生命周期中，细胞壁会经历重塑和重建，因此细胞壁通常可以分为两类：围绕生长细胞的初生细胞壁和围绕分化细胞的增厚的含有木质素的次生细胞壁。一般来说，所有的细胞壁都还有纤维素，非草性被子植物的细胞壁通常富含半纤维素（由木葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖组成）、果胶、结构蛋白、和异质木质素，草性被子植物的细胞壁也含有这些组分（木聚糖和果胶比例较低，混合葡聚糖含量较高）。裸子植物的细胞壁成分与非草性被子植物类似，但木质素是均匀的。相比之下，苔藓植物和轮藻植物的细胞壁并没有清楚的初生和次生之分，此外，它们还缺乏木聚糖和木质素，富含糖醛酸。对于不同的植物类型，可选用不同的酶混合物进行细胞壁的处理。如下表所示。
主要的一些次生代谢产物，在植物对环境的适应过程中起重要作用，通常包括各种多酚，这些酚有很高的可能会与核酸形成复合物，从而阻碍核酸与其他物质的反应，从而影响转录分析。作者等人发现，通过在预透化试剂和cDNA合成混合物中添加40-kDa 聚（1-乙烯基吡咯烷酮-2）(PVP)可以 克服这一障碍，从而增加了微阵列表面总转录本的捕获数量。
标准的空间转录组流程应用于植物的第三个挑战是植物组织的解刨。一些组织部位在冷冻过程中容易破裂，为保持组织的完整形态，可以在冷冻前，给组织表面涂一层超薄的Tissue-Tek OCT ( supplied by Sakura Finetek)。
作者等人通过对拟南芥花序的纵切面进行研究，获得了~93%的特异性、~71%的准确性、~60%的灵敏度和6.5%的假阳性率，并且空间基因表达研究分析在8个组织区域中鉴定出141个差异表达的基因，证明该方法也可以成功的应用于高度异质性的组织部位。基于以上成功的案例，作者在文章的最后详细列举了在各个实验环节（组织准备和包埋、冷冻切片制备、固定、预透化、透化、反转录、组织去除、cDNA收集和建库）具体的实验步骤、注意事项以及所用到的主要的试剂及仪器耗材名称和来源，在此不一一赘述，有需要的小伙伴可以跟小编沟通奥。此外，空间转录组技术的发展已经实现了单细胞分辨率，百迈客提供的空间转录组测序利用10x Visium等组织切片与转录组测序结合，实现了空间信息和转录本信息的获取，并且联合10x Genomics 单细胞测序，更加全面探索组织内细胞异质性和空间分布作用，真正实现了空间转录组单细胞分辨率分析。如果想要让您的文章深入探索组织细胞多维分析，快来与我们取得联系吧，还有年末活动促销各种大奖等您来拿，欢迎各位老师致电锤询！
文：GJY
排版：市场部