单细胞转录组学首次揭示宫颈癌中内皮细胞的肿瘤内异质性和转录活性
单细胞平台：10x Genomics
摘要
主要结果
1.CC及癌旁组织的单细胞转录图谱和细胞组成
宫颈组织由多种细胞组成，如上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、子宫内膜间质细胞和免疫细胞（图1A）。由于血液供应丰富，CC往往体积较大（图1B）。为了探讨CC组织中细胞组成的多样性，我们利用10xGenomics平台对从CC和癌旁组织分离的所有活细胞进行了scRNA-seq分析。共有11289个来自肿瘤标本的细胞和9649个来自癌旁的细胞符合质量控制（QC）指标。使用t-SNE的聚类方法，我们确定了13个细胞簇（图1C）。利用差异表达marker基因鉴定了7种细胞类型 （图1C和1D，1E）。第0、1、3和8组细胞表达高水平的EPCAM、CDH1和CDKN2A，被归类为上皮/癌细胞。我们发现肿瘤样本中上皮/癌细胞的数量远高于正常样本。细胞簇4具有高水平的EGFL7、EMCN和PECAM1，并被确定为内皮细胞（EC）。细胞簇2和细胞簇6选择性表达ACTG2，为平滑肌细胞。细胞簇7内细胞表达高水平的COL1A2和APOD，为成纤维细胞。鉴于SUSD2的高表达水平，第5、9和12细胞簇中的细胞被指定为子宫内膜间质细胞。我们还发现了一小部分免疫细胞，包括巨噬细胞（细胞簇10）和淋巴细胞（细胞簇11）。同时，我们还获得了每个细胞簇的几个重要基因，以供进一步分析。
2.单细胞转录组学显示CC细胞肿瘤内异质性
本文共检测到10457个上皮/肿瘤细胞，10395个来自肿瘤样本，62个来自癌旁（图2A（修订C1应为橙色）和2B），这些细胞被分为四个细胞簇（簇0、1、3和8）（图2C和2D）。根据每个细胞簇的标记，被分成四个具有不同生物学功能的细胞群。我们发现增殖相关基因，如MKI67（KI67基因）、CCNB1和TOP2A在细胞簇3中富集（图2C和2D）。KI67是一种主要通过增强组织蛋白酶活性而在细胞增殖中发挥作用的蛋白质。根据以往的研究，KI67在CC中的高表达与肿瘤大小、肿瘤进展和淋巴结转移有关。基因集富集分析（GSEA）表明，细胞周期、细胞周期、细胞凋亡、细胞凋亡和肿瘤转移等生物学途径与KI67的表达密切相关，卵母细胞减数分裂、RNA降解、脂肪酸代谢和生物合成在细胞簇3中富集（图2E）。同时，细胞簇3具有更高水平的G2/M信号，提示高增殖活性。细胞簇1显示高水平的CEACAM6、CD55和GJB6。CEACAM6是一个癌胚抗原家族，广泛表达于上皮细胞、内皮细胞和造血细胞（包括中性粒细胞、T细胞和NK细胞）中，据报道，CEACAMs能够传递导致多种效应的信号，包括促肿瘤、血管生成、中性粒细胞活化和淋巴细胞活化。事实上，CEACAM1、CEACAM5和CEACAM6目前被认为是黑色素瘤、肺癌、结直肠癌和胰腺癌的有效临床生物标记物和有希望的治疗靶点。然后，根据标记基因集进行GSEA分析，揭示免疫调节信号通路富集在簇1中（图2E）。发现簇0中的细胞呈现高水平的DEFB1、KRT5、CXCL10、WARS、LY6D、CRABP2、CXCL9、PHOV、C10orf99和PYCARD，并且在多种特征和代谢相关的信号途径中富集，例如类固醇生物合成、错配修复和过氧化物酶体（图2E）。推测0群中的这些细胞是肿瘤进展的终末期。然而，簇8中的细胞表现出干细胞相关基因的高表达，如SOX2和ALDHA1，推测它们是肿瘤进展过程中癌细胞的起源（图2E）。
来自癌症基因组图谱（TCGA）CESC队列的样本被分成四个主要组，定义为聚类A-D，通过K-均值聚类（样本为K=4，基因为K=5）和来自scRNA-seq数据的标记基因（图2F）；癌症基因组图谱A，B，C，D组分别和scRNA-seq的细胞簇8，0，3，1分别对应，具有相应的生物学功能，如A组显示细胞发育和分化；B组表现出对氧水平、缺氧和糖皮质激素以及细胞外基质（ECM）组织的反应；C组表现为核分裂、细胞器分裂、染色体分离和纺锤体组织，提示增殖状态；D组表现为对病毒、肿瘤坏死因子（TNF）-a信号通路的反应，对干扰素（IFN）-g的反应，提示炎症反应状态，且与良好的生存结果相关。这些结果表明来自单细胞转录组学的发现提示了相关的临床后果。这些发现进一步证明了单细胞转录组学在理解CC肿瘤生物学中的实际应用。
3.重构宫颈癌干细胞的发育轨迹
肿瘤干细胞理论认为并非所有的肿瘤细胞在自我更新、肿瘤发生和维持潜能方面都是平等的。肿瘤干细胞是肿瘤细胞的一个小亚群，在肿瘤发生中起着决定性的作用，而大多数肿瘤细胞在短暂分化后死亡。细胞表面标志物和转录因子，包括SOX2和乙醛脱氢酶1（ALDH1），已用于从不同肿瘤（包括CC）中分离和鉴定CSC群体。CSC标记基因ALDH1A1和SOX2在簇8中显著较高（图3A和3B）。为了进一步研究从表达SOX2和ALDH1A1的干细胞样肿瘤细胞到分化癌细胞的发育过程，我们在簇8中进行了亚群鉴定，分析发现了6个亚群，每个亚群都有一个特定的功能类别。我们发现SOX2和ALDH1A1在亚群1中的表达水平高于其他亚群（图3C）。GSEA分析显示，亚群1显示出高水平的干细胞相关信号通路，如转化生长因子（TGF）-β信号通路、Hedgehog信号通路和Notch信号通路（图3D）。这些发现揭示了宫颈干细胞的层次结构和异质性。
为了确定肿瘤细胞在不同发展阶段的转录适应性，我们进行了伪时间分析以揭示与功能变化相关的基因表达轨迹。根据簇8细胞转录活性的变化，我们定义了四个基因共表达模块。模块1（指状态4和状态6中的细胞）显示了如细胞分化等特征，亚群1与模块1的功能注释和状态表征一致。模块2（指处于状态5的细胞）获得DNA/RNA分解代谢相关基因，对应于亚群2；发现亚群3、4和5中的大多数细胞位于假时间轨迹的另一端，分别对应于模块3和模块4（图3E和3F）。模块3（指处于状态2的细胞）的功能注释呈现生物学功能，例如T和B细胞受体信号通路和IgA产生的免疫网络（图3E和3F）。模块4（指处于状态1的细胞）显示谷胱甘肽代谢、RNA转运和β-丙氨酸代谢，包括JUN、SKP1、PSMB9、ACTB和PSMA5。此外，亚群0中的细胞分布在假时间尺度的轨迹中，具有ECM受体相互作用、醛固酮调节的钠重吸收和mRNA监督途径（图3E和3F）。我们的分析显示，癌细胞在早期表现出较高的分化潜能，然后迅速增殖。在肿瘤生长的后期，肿瘤细胞表现出一系列的功能，如免疫应答、细胞代谢、信号转导等。这些结果反映了肿瘤进展的复杂性和异质性。
图3.宫颈癌干细胞在肿瘤进展中的表达模式
（A） 小提琴图显示了CC中四个癌细胞簇的代表性干相关标记物的表达(B） ALDH1A1和SOX2在来自THPA数据库的CC正常和癌症样本中的表达(C） 小提琴图显示了在簇8的6个癌细胞亚群中代表性的干细胞相关标记物的表达。（D）热图显示了簇8的6个癌细胞亚群中代表性的干细胞相关信号通路。（E）簇8中癌细胞的伪时间轨迹，其基因表达谱由单眼2。每个点对应一个细胞(F） 差异表达的基因（行）沿着伪时间
4.内皮细胞在肿瘤和正常组织中发挥着不同的功能
血管生成在正常和疾病组织中都很重要，是肿瘤治疗的关键靶点。scRNA-seq检测肿瘤及癌旁正常组织中的1803个内皮细胞。hallmark通路基因特征分析强调代谢调控是肿瘤驱动内皮细胞（TECs）最丰富的特征。特别是，前10个差异表达基因（DEGs）上调或下调，主要与代谢过程有关（图4A）。因此，我们对上调或下调的DEGs进行了丰富性分析，发现TEC在肽酶活性调节、蛋白质水解调节和细胞外结构组织方面丰富，而正常ECs（NEC）具有基本的生物学功能，如血管系统发育、血管生成、EC迁移和内皮细胞发育（图4B和4C）。同时，GSEA分析还表明，TECs富含外源性代谢、PPAR信号通路、氨基酸合成、碳代谢和糖酵解/糖异生等功能，对肿瘤细胞代谢有重要作用。此外，其他富集途径包括DNA复制、柠檬酸循环（TCA循环）和细胞周期，这对细胞增殖很重要。
免疫调节中最显著的下调途径是同种异体排斥和肠道免疫。与信号转导相关的其他重要信号通路包括AGE-RAGE、PI3K-Akt、cGMP-PKG、细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路（图4F）。众所周知，内皮细胞是循环免疫细胞、炎症介质、小分子和肿瘤细胞之间的主要界面，在从组织到免疫系统的信号传递和表位呈现中起着重要作用。基因类别包括与趋化性相关的基因（CCL2、CCL14、CXCL2、HLAQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、，CD34、CD74和IL1R）和免疫细胞归巢（ICAM1、ICAM2和ICAM4）（图4D和4E）。令人惊讶的是，上调基因与代谢调节有关，而下调基因与免疫激活有关。总之，这些结果表明TECs转录调节以上调其与肿瘤发生相关的代谢功能，并下调其抗原呈递和免疫细胞归巢活性，从而促进肿瘤免疫耐受。这些结果提示抗血管生成治疗和免疫治疗对CC患者的潜在协同作用。
（A） 肿瘤与正常组织ECs差异表达基因火山图。前10个上调和下调基因被分别注释；(B） 上调DEGs的基因富集分析；(C） 下调DEGs的基因富集分析；(D） 小提琴图显示了在NECs和TECs之间参与血管生成的特定基因的表达分布；(E） 小提琴图显示了NECs和TECs之间参与免疫激活的特定基因的表达分布；(F） GSEA显示NECs和TECs之间通路活性的差异。
图5.内皮细胞的异质性及其发展轨迹
（A） t-SNE图显示了EC簇（细胞簇4）的七个亚群；(B）小提琴图显示了7个亚组中代表性动脉和静脉marker基因的表达；(C）小提琴图显示了7个ECs亚群中代表性毛细血管marker基因的表达；(D）利用monocle2推测ECs转录组的伪时间轨迹，每个点对应一个细胞；(E） 沿着伪时间（列）的DEGs（行）；(F–H） 每个EC基因集的基因功能分析。
5.异质性分析揭示了ECs的迁移轨迹
为了鉴定各种EC表型，我们在EC细胞簇中鉴定了7个亚簇（图5A）。接下来，我们尝试鉴定每个亚群的标记基因，并将它们分配给已知的EC类型。亚群0和6共享大多数表达相似的基因，而亚群1、4和5显示出最相似的基因。然而，亚群2和3没有共享特定的基因。进一步的分析显示，动脉标志基因ELN和EGR1在亚群0和6中最丰富，而静脉标志物基因LRG1和ICAM1在亚群1、4和5中被鉴定（图5B）。表达IGFBP3和ARL15的小动脉内皮细胞命名为“毛细血管-动脉”内皮细胞；同样，表达EMCN和FOS的静脉内皮细胞定义为“毛细血管-静脉”内皮细胞（图5C）。
与传统的bulk RNA-seq相比，scRNA-seq能够消除肿瘤微环境（TME）引起的差异。根据转录变化定义了三个基因共表达模块（图5D和5E）。模块1显示了如RNA分解代谢过程、核糖体生物发生和翻译起始等功能，代表了代谢的触发（图5F）。模块2具有ATP代谢过程和三磷酸代谢过程。该程序提出了更多的动脉EC与突出的代谢能量信号途径（图5G）。由于它与细胞迁移和血管形成密切相关，因此对动脉标志物（ELN）高表达的内皮细胞具有重要意义。模块3显示Wnt信号通路和抗原处理和呈现功能（图5H）。大多数TEC聚集在轨迹末端。这些细胞表现出高水平的动脉、静脉和毛细血管标志物，如IGFBP3、FABP5、NKFB1和VEGFA，这与正常标本的内皮细胞maeker基因不一致。
6.ECs与肿瘤/免疫细胞的相互作用可能促进肿瘤血管生成
耐药性是抗癌治疗中的一个主要问题。自从Folkman提出肿瘤生长依赖于血管生成的概念以来，肿瘤血管已成为肿瘤治疗的重要靶点。靶向ECs可能比靶向肿瘤细胞更有效。ABC转运体是跨膜蛋白家族中最大的家族之一，在肿瘤多药耐药中起着重要作用，近年来的研究表明，ABC转运体在肿瘤内皮细胞中高表达，并可能对化疗产生耐药治疗。最具广泛特征的转运蛋白是ABCB1和ABCG2。我们的数据为发现新的细胞调节因子作为潜在的预后标志物和/或药物靶点提供了机会。如图6A-6C所示，ABCB1和ABCG2在细胞簇4中表达尤其明显，TECs中的表达水平高于NEC（图6B），表明ABC转运蛋白可能通过药物作用于ECs而影响化疗耐药。Akiyama等报道肿瘤分泌因子诱导ECs中ABC转运蛋白的表达。他们证明肿瘤分泌的VEGF可能诱导ABC转运体的上调。为了验证这一概念，我们探索了肿瘤细胞与内皮细胞之间的联系，发现VEGFA在TEC中高表达，在NEC中低表达。建立了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）模型来研究这些基因之间的相互作用。我们对模块中的基因进行功能富集分析，发现它们主要富集于细胞间粘附和信号转导。然而正常样本中的重要基因在萌芽血管生成和细胞增殖中富集。最近，Lambrechts等人通过scRNA-seq分析肺癌组织中的内皮细胞，得出了相似的结论，这些结果表明肿瘤血管生成来源于正常的内皮细胞。这一过程受癌细胞分泌的多种细胞因子调控。
为了系统地研究肿瘤细胞或免疫细胞与内皮细胞之间的相互作用，我们构建了一个基于CellPhoneDB的细胞-细胞通信网络。这种方法强调不同细胞类型之间的相互作用，这些细胞可能参与血管生成、免疫细胞募集和免疫调节（图6D）。通过比较肿瘤细胞和正常人ECs中前50个重要的legend-receptor对，我们分别鉴定出16个特异的legend-receptor对。我们发现与肿瘤中的免疫调节相关的legend-receptor对，例如CD74-COPA、CD74MIF、CD74-APP、TNFRS10-TNFSF10、TNFSF10-RIPK1、HLA-DPA1和HLA-C-FAM3C（图6E）。然而，在正常样本中，信号转导相关对如DSG2-DSC3、DSC2-DSG2、EGFR-TGFB1、TGFB1-aVb6复合物和CEACAM5-CEACAM6表现出高表达水平（图6F）。同时，根据ECs中的受体基因进行GO基因富集分析。结果表明，TECs与ephrin受体、轴突导向、细胞-细胞粘附、内皮细胞的建立、EC的分化和发育有关，反映了肿瘤的血管生成和进展。然而，在NECs中，这种分析可以确保ECM的组织、磷脂酰肌醇3-激酶信号和蛋白激酶B信号的调节，这代表了ECs的正常生物学功能。然后，我们还比较了肿瘤和正常组织中免疫细胞和内皮细胞的重要legend-receptor对。令人惊讶的是，癌细胞和内皮细胞之间的大多数legend-receptor对也在免疫细胞和内皮细胞之间表达（图6G和6H）。这些结果表明肿瘤细胞和免疫细胞的协同作用导致肿瘤血管生成。
图6 ABC转运蛋白的表达水平和癌/免疫细胞与内皮细胞之间的细胞-细胞信号交流
（A） t-SNE图显示ABC转运蛋白在所有细胞簇中的表达水平；(B） 箱线图显示了肿瘤和正常样本之间ABC转运蛋白的表达水平；(C） 小提琴图显示在EC簇中ABC转运蛋白表达水平较高；(D） 肿瘤细胞与内皮细胞的联系；(E） 细胞-细胞连接显示肿瘤细胞与内皮细胞之间的特异性legend-receptor受体对;(F） 细胞-细胞连接显示相邻正常标本中上皮细胞和内皮细胞之间的特异性legend-receptor;(G） 细胞-细胞连接显示肿瘤样本中免疫细胞和内皮细胞之间的特异性legend-receptor;（H） 细胞-细胞连接显示正常样本中免疫细胞和内皮细胞之间的特异性legend-receptor对。
主要结论
近年来，肿瘤和微环境的异质性在各种实体肿瘤中得到了很好的定位。然而，仍然不清楚这种异质性如何导致CC的治疗失败和肿瘤发展。本研究首次在单细胞水平上证实了CC在生物学和转录组学上的异质性。肿瘤细胞异质性由不同的CC细胞marker基因确定，肿瘤样本中CSCs的存在与肿瘤进展相关，这表明单个细胞的不同转录组可能反映了其肿瘤生物学特性。同时，我们的数据也为TECs的异质性提供了证据，揭示了ECs的状态转变。这些结果反映了肿瘤的真实生物学性质应该在单细胞水平上进行。因此，我们的研究建立了一个可行的方法来研究CC的肿瘤内异质性和血管生成。
由于scRNA-seq局限于转录水平，这些群体的功能需要进一步研究。然而，我们为每一个亚群提供的强大的marker基因和更大的细胞数将构成将scRNA-seq方法应用于CC的基础，使我们能够理解这些亚群及其转录组是如何参与各种病理过程的。更重要的是，单细胞转录组学的力量使得鉴定稀有细胞亚群和解释肿瘤细胞与内皮细胞之间的联系成为可能。因此，我们预计这些发现将提供重要线索，以补充这一具有挑战性的开发。
文献下载：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33996252
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