Nature Medicine | 单细胞免疫组库揭示溃疡性结肠炎中结肠T细胞图谱

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研究标题：Single-cell atlas of colonic CD8⁺ T cells in ulcerative colitis

发表期刊：Nature Medicine

影响因子：IF:36.13

发表时间：2020.8.3

实验技术：RNA-seq、sc-RNA seq、sc-TCR seq、CITE-seq、CyTOF等

研究背景

炎症性肠病(IBDs)的病症，如溃疡性结肠炎（UC），涉及免疫介导的组织破坏、继发屏障功能障碍、遗传风险和生态失调的组合。结肠固有层含有大量的组织内的CD8⁺ T细胞，可能导致IBD的组织损伤。尽管有证据表明CD8⁺T细胞参与了IBD病症，而异质性的程度，转录调节和不同群体的效应功能尚未被研究清楚。此外，在IBD中它们的联系，层级以及如何通过动态重塑来影响炎症还不清楚。作者对健康人和UC患者的结肠CD8⁺细胞进行多模式单细胞分析，定义活动性疾病中的T细胞改变。作者联合T细胞受体(TCR)分析识别细胞的状态及其与上皮细胞亚型的相互影响，从而定义了它们功能上的相互关系。

研究结果

一、人结肠CD8⁺T细胞转录图谱作者使用基于液滴的单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析了来自3名健康志愿者和3名UC患者的结肠CD8⁺ T细胞(图1a)。在质控下，对8581个细胞的基因数据进行聚类分析。使用UMAP算法得到14个CD8⁺ 细胞亚群（图1b），并检测得到特异性基因在不同的细胞亚群中的表达情况(图1c&d)。作者进一步使用GO分析研究了不同亚群特异性基因的表达特征（图1e），发现在DP和IL26⁺细胞中，IL-17细胞通路具有局部活性，同样在自然杀伤性(NK)通路中，IEL簇和一些IL26⁺细胞高度富集（图1f）。这些数据揭示了结肠内CD8⁺ T细胞的异质性，包括具有先天和适应性混合特征的IL26⁺细胞和DP调节性CD8⁺ T细胞。
图1 | 结肠CD8⁺ T细胞转录图谱

 二、UC患者结肠CD8⁺ T细胞的动态重组

作者发现UC患者中CD8⁺ T细胞亚群有显著改变。例如，T_RM-like T细胞在正常人中占比45%,而在UC中仅占CD8⁺ T细胞的10%。其他细胞亚群也有变化，如活性效应T细胞和IL26⁺细胞等（图2a）。进一步，在这些亚群中，作者鉴定出997个不同表达的基因（DEGs）（图2b）。GO富集分析显示上调基因集中在I型和II型干扰响应、T细胞激活、细胞因子生成、细胞杀伤和上调固有免疫应答等途径。鉴定出的615个DEGs仅在一个细胞簇中差异表达，并且只有34个基因在4个以上的集群中显著差异表达。作者假定这些结果反映了在IBD效应亚群中不同的活性通路，观察到更高层次的共同刺激，包括CD28，TCR信号，抗原加工，抗原呈递，以及PD1和CTLA4途径（图2b）.

   因为单细胞分析提供了高分辨率的表达数据，作者接下来探索结肠内IBD基因易感性位点的转录组情况。研究发现来自UC相关基因组的全基因组关联研究（GWAS）基因总体上富集度更高，在活动性炎症中表现出表达特异性（图2c）。IELs和IL26⁺细胞被一些高表达和特异性的基因驱动，整体信号富集最高（图1c&d）。

由于CD8⁺ T细胞可能通过与结肠上皮细胞的直接相互作用导致UC组织损伤，作者探索了健康和UC中T细胞和上皮细胞受体配体的配对。研究发现吸收细胞而非分泌性细胞与多重CD8⁺细胞亚群间的谱系特异性相互作用，包括了IL18-IL18R1、IL18RAP和TNF-TNFRSF1A信号途径（Fig 2. d-e）。
图2 | UC活跃期结肠CD8⁺T细胞重塑

三、UC患者中可调控结肠CD8⁺可塑性的转录网络

为了定义IBD中CD8⁺ T细胞可塑性的调控网络，作者进行了基因共表达分析，通过给每一个活化基因模块进行打分，这些活化基因与转录因子顺势调控序列共表达和富集，从而鉴定出273个活化TF活性相关回路。层次聚类展示了特异性T细胞簇的表达唯一性，表明了一种新的转录调控形式的建立（图3a）。作者发现了一个EGR1和EGR2的模块，它们的活性定位于T_RM细胞和GZMK⁺效应物的细胞过渡梯度（图3a）。这些结果表明作者最初的聚类分析忽略的一个独特的T细胞状态。这些过渡细胞同样展现出 IFNG、TNF等基因网络的高表达、局部共定位（图1d）。

在单细胞图谱中，作者发现了先天CD8⁺淋巴细胞簇，包括MAIT细胞和γδ IELs细胞。MAIT几乎没有异质性。同时研究发现在CD8⁺ IEL-like簇中，存在一个高比例的Vδ1 γδ 细胞。为了更好地在单细胞水平研究IEL细胞群，作者进一步研究结肠上皮细胞 scRNA-seq的数据集中捕获的T-细胞。使用927个细胞，研究发现大多数CD8⁺细胞，只有少数是CD4⁺细胞。通过marker基因的组合，包括CD6、LAYN、GNLY，CD8⁺细胞可以分为七个簇。尽管IELs的固有特征已经被研究阐述，作者发现在UC中增加的适应性CD8⁺ IL26⁺，同样表现出与IEL转录图谱不同的先天性特征。

 在UC中，作者发现一个包含GZMK+效应子和IL26+细胞富集的细胞簇，他们有一个“耗竭”的特征，这也是肿瘤浸润CD8 + T细胞的标志（图1c&图3a）。作者进一步研究了最近发表的肝脏、乳房和结直肠癌中肿瘤浸润T细胞(TILs)的scRNA-seq数据集，但是，在耗竭T细胞中类似的17特征为UC所特有。表明或是Tc17/ILC3样细胞在UC中容易受到慢性过度刺激，或这种表型是在“后效应”细胞状态中获得。
图3 | 转录模块、拟时间以及克隆定义的UC CD8⁺ T 细胞谱系

因为实验数据可能捕获了T细胞从一个转录组状态过渡到下一个转录组态的过程，所以作者进行了拟时间分析，捕获了从一开始的naïve-like细胞到记忆、T_RM、GZMK⁺效应子，最后到IL26⁺细胞的线性轨迹（图3b,c）。为了解驱动拟时间成分的生物学过程，作者探索哪些基因与拟时间在表达上共同变化。聚类了所有被鉴定为显著(FDR)< 1%)与拟时间共变的基因（图3d），与集群分布保持一致，幼稚和早期中央记忆T细胞标记物（如CCR7）表达较早，而共同抑制受体(HAVCR2，CTLA4)表达较晚（图3b&c）。作者发现了一个强烈的信号，随着协同抑制分子的逐渐增加，T细胞的激活标记物也随之增加，这与拟时间簇分布的结果一致。同时还观察到BATF、CTLA4、HAVCR2、LAYN和TNFRSF9的表达增加，而与效应功能相关的分子，如GZMK，则持续丢失（图3c-e）。

接下来，作者试图通过匹配的单细胞TCR -αβ分析来阐明亚型之间的谱系和克隆动态。发现naïve, MAIT 和DP T细胞亚群表现出高度多样化的克隆结构，多数细胞都表达一个特异的 TCR CDR3 序列对（图3f）。在来源于健康结肠的CD8+细胞中，T_RM样细胞富集程度最高，而UC相关的克隆T细胞明显富集IL26⁺细胞，因为每个样本中最大的克隆的主体组成了UC的这个亚群。这些观察结果与拟时间分析一致，因为UC中未扩增的细胞在轨迹的开始富集，并且扩增最多的克隆占据了末端（图3g）。

尽管一些克隆型可能由于检测到的群体之间的边界有些不稳定而归于错误的集群，但研究检测到在连接遥远群体的四个或更多集群之间共享的多个克隆型实例。因此，TCR库分析揭示了UC中单个TCR克隆通过不同T细胞状态转运的表型历程。

四、对结肠CD8⁺ T细胞的多组学分析证实了UC的异质性和重构

为了在蛋白水平上验证单细胞特征，作者接下来通过CITE-seq结合细胞hashing技术整合9062个细胞的转录组和蛋白质组特征，对另外7个UC和5个健康样本进行了分析(图4a&b)。

综合数据分析显示，作者最初的scRNA-seq分析和随后的CITE-seq分析具有很高的可重复性（图4b-d）。结果能够将效应细胞分成两个额外表达簇--TNF(TNF+效应器)和EGR1/EGR2 (EGR1⁺效应器)，这是作者之前注意到的T_RM和GZMK +效应细胞之间的过渡亚群。

通过CITE-seq，研究人员将14个蛋白质的表征映射到CD8⁺细胞亚群上（图4e&f）。进一步证实了研究人员先前观察到的群体之间组织驻留和迁移动态的差异。此外，研究发现共抑制分子PD1，TIM3和LAG3主要标记CD103 ⁺细胞，包括GZMK ⁺效应子和IL26 ⁺细胞，而较少的CD103^–细胞在蛋白质水平上表现出慢性T细胞刺激的特征（图 4. e&f）。
图4 | 利用CITE-seq和细胞Hashing技术对CD8⁺ T细胞进行转录组和蛋白质组分析
五、UC重构CD8⁺ T细胞的多模态数据集成与功能分析

利用CITE-seq蛋白表达进行聚类分析，研究发现所选的14个蛋白足以描述仅在组织常驻、耗竭和记忆方面的关键特征，大部分IL26⁺细胞属于CD103⁺ PD1⁺群体（图4f&g）。作者开发了一个质谱流式细胞技术(CyTOF)panel，合并了39个在特异性scRNA-seq簇中表达的marker。使用CyTOF数据作为参考，作者接下来进行多模态单细胞数据整合以推断这两种表达模式之间最可能的对应细胞。许多关键marker在蛋白和信使RNA数据集中显示保守的共表达，在某些亚群如CCR7⁺/ naïve细胞中，观察到mRNA与CyTOF之间的一对一关系。而且IL26⁺细胞富集于IL23R+, NKp30/NCR3⁺,T_RM和枯竭集群（图5c&d）。

为了评估UC相关CD8⁺亚群的功能，作者采用了肉豆酸醋酸酯(PMA)和离子霉素进行体外刺激。使用CyTOF panel，作者从另外4个健康供体和3个炎症性UC供体中提取细胞。所有健康组都出现了CD103⁺ T_RM细胞亚群，这些细胞表达TNF-α和 IFN-γ.。与此相反，UC供体重新激活的细胞富集了GZMK⁺效应标志物（图5e-g）。奇怪的是，几乎没有IL23R⁺细胞(主要是IL26⁺，部分MAITs和DP细胞)对刺激有反应。这些结果表明UC细胞中观察到的克隆扩增的IL23R⁺/IL26⁺细胞可能具有有限的效应功能，这与它们转录相关“后效应子”终末分化特征一致。

图5 | UC CD8⁺ T细胞功能CyTOF分析

六、IL-26可减轻急性结肠炎的严重程度

IL-26在结肠炎中的作用尚不清楚, 尽管IL26基因在啮齿动物中缺失，其异二聚体受体包括IL-20RA和IL10RB在小鼠体内表达，也能对人IL-26发出信号响应。作者使用了人源化IL-26转基因小鼠模型来评估IL-26对急性结肠炎的严重影响程度。作者将hIL-26Tg小鼠和对照组B6小鼠暴露于饮用水中2.5%的DSS，并在第0天和第3天用抗IL-26单克隆抗体(mAb)或对照组单克隆抗体进行腹腔给药（图6a&b）。研究发现暴露于DSS WT小鼠的总炎症分数显着高于给予对照抗体的hIL-26Tg小鼠。且在给予抗IL-26 mAb后，在这些hIL-26Tg小鼠中DSS的炎症作用得以恢复（图6.c&d），这些结果表明IL-26在小鼠中可能具有保护作用。

为了描述IL26表达的效果，作者接下来对基线和DSS处理的结肠组织进行RNA-seq。主成分分析(PCA)突出了两者之间的明显区别（图6e）。接下来对鉴定出的295个差异表达基因进行性GO分析，突出显示了WT动物中强烈的T细胞和B细胞活化以及白细胞增殖信号，而在Tg动物中则明显降低（图 6.f）。

接下来，作者比较了DSS条件下WT和Tg小鼠的RNA数据，鉴定473个差异表达基因（图6g），与基线水平的表达谱一致，在hIL-26小鼠中再次观察到免疫应答相关转录本的表达明显下降以及在基质区室特征的增加（图 6. g–i）。基于这些结果，作者提出IL-26的作用与报道的细胞因子(例如Il33和Tnf)在促进环境依赖性肠屏障完整性或急性实验性大肠杆菌粘膜损伤中的作用有关。此外，此结果为IL-26在急性结肠炎中的免疫调节作用提供了初步证据。

图6 | IL-26可减轻急性结肠炎的严重程度

文章总结

具有抗原经验的结肠淋巴细胞，如组织驻留记忆CD8⁺ T细胞，可对重复抗原暴露做出迅速反应。然而，它们的细胞表型以及它们驱动免疫调节和炎症的机制尚不清楚。作者使用单细胞转录组和T细胞受体库分析和质谱流式细胞技术，汇编了健康人和溃疡性结肠炎(UC)人的结肠CD8⁺ T细胞无偏图谱。本文揭示了CD8⁺ T细胞组成的广泛异质性，包括扩张效应细胞和后效应最终分化的CD8⁺ T细胞。而UC相关CD8⁺效应T细胞可触发组织破坏并产生肿瘤坏死因子(TNF)-α，后效应细胞获得先天的特征，采取调节功能可能减轻过度炎症。从而作者确定健康和UC患者中结肠CD8⁺ T细胞表型，定义了它们的克隆关系并且描述了终末分化失调的UC CD8⁺ T细胞特征---在人源化IL-26转基因小鼠模型中表达IL-26来减轻急性结肠炎。 

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文：zml

排版：市场部

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