单细胞转录组+ATAC-seq+RNA-seq：解析西妥昔单抗耐药性

年末促销倒计时：24天

百迈客推出年末活动促销，发文有礼、推广有礼以及多种产品钜惠来袭，百迈客为您倾情打造科研福利，您还在等什么？快快行动起来领取您的超级奖励吧！（详情请见“决战2020！品类全，力度大，仅此一次！”）

研究背景

在肿瘤细胞仍然对治疗有反应的同时，识别潜在的耐药机制对于延缓获得性耐药性至关重要。

研究结论

本文发现西妥昔单抗诱导的瞬时适应性转录和表观遗传学改变，是具有异质性和细胞类型依赖性的；当肿瘤细胞仍然对治疗敏感时，发生了独立的耐药机制。

数据结果

1. scRNA-seq结果

TFAP2A和EMT在不同细胞系中的表达是不同的

根据HNSCC细胞系对西妥昔单抗的敏感性，并经增殖实验证实，本文选择了SCC1、SCC6和SCC25细胞系，进行了单细胞RNA-seq(scRNA-seq)。基于全转录图谱，每个细胞系彼此完全分离(图1b)，表现出了细胞系间的异质性。在SCC6(图1c)中，处理（西妥昔单抗）的细胞和未处理（PBS）的细胞之间有明显的分离，这表明仅在5天内，抗EGFR治疗诱导了显著的转录变化。

三株细胞的scRNA-seq分析表明，TFAP2A和VIM基因的表达具有异质性。西妥昔单抗处理和未处理的SCC1表现出高水平的TFAP2A和VIM表达的缺乏(图1d，e)，表明治疗对该特定细胞系中的这两个标记物没有影响。抗EGFR阻断后，SCC6细胞VIM的表达发生了一定的变化，未处理细胞与处理细胞相比呈下调趋势。VIM表达的改变与TFAP2A状态无关(图1d，f)，西妥昔单抗的阳性和阴性细胞比例没有明显变化。有趣的是，在EGFR阻断的情况下，VIM在大多数处理克隆中呈阳性表达(双阳性)，而未处理的SCC25细胞表达或缺乏VIM的比例大致相同(图1d，g)。

图1 西妥昔单抗处理和未处理的HNSCC细胞株的scRNA-seq图谱

2. RNA-seq结果

西妥昔单抗在体外诱导HNSCC中基因表达的瞬时变化

通过RNA-seq数据分析，评估TFAP2A靶标和EMT标记基因的变化时间。西妥昔单抗诱导的转录变化几乎可以在治疗后立即被检测到。对所有时间点的差异表达分析表明，在三种HNSCC细胞系中，作为对抗EGFR治疗的反应，数百个基因的转录图谱发生了变化，这些变化最早发生在治疗后24小时。

尽管在SCC1中TFAP2A和VIM的表达没有变化，但在这两个途径中的其他标志物仍有显著的变化，这些变化可能与获得性西妥昔单抗耐药性的未来发展有关。细胞系SCC1和SCC25在西妥昔单抗治疗后立即发生转录变化，大多数基因在治疗的前24小时发生表达变化。SCC6对抗EGFR治疗的转录反应需要更长的时间，大多数变化在治疗96h后可见，这与观察到的该细胞系对西妥昔单抗治疗的行为一致。

图2 西妥昔单抗对TFAP2A靶点和EMT标志基因的影响

3. ATAC-seq结果

西妥昔单抗体外治疗早期可检测到染色质变化

利用ATAC-seq检测西妥昔单抗治疗5天后细胞和未治疗对照细胞中染色质的可及性，验证在西妥昔单抗治疗早期是否发生染色质重塑，以及它是否影响TFAP2A靶点和EMT基因。

分别对每个细胞系进行差异结合分析，以确定西妥昔单抗引起的细胞特异性染色质的变化(图3b-d)。这三种细胞系都表现出特殊的染色质变化，将处理过的和未处理过的样本分开。作为对治疗的反应，SCC1和SCC6显表现出显著的启动子重组，分别有1821和3057个位点 (图3b，c)。作为短期治疗的结果，SCC25具有11,402个启动子结合位点 (图3d)。基因集富集分析发现在西妥昔单抗处理SCC1细胞系期间，只在TFAP2A途径的四个基因中检测到启动子区域的重组，并且EMT启动子没有变化(图3e，f)。这表明在该细胞系中，这两条途径的转录变化不受染色质重塑的调节。

ATAC-seq的研究结果表明，即使在体外将HNSCC细胞短期暴露于西妥昔单抗之后，与获得性耐药性相关的途径中的基因也会发生重塑，这可能会导致转录因子结合的改变。

图3 西妥昔单抗短期处理过程中染色质结构发生变化

4.验证实验

4.1 结合异质性测量和RNA速度分析，揭示西妥昔单抗对基因表达的动态变化

通过表达变异分析(EVA) 表明在SCC1、SCC6和SCC25中，西妥昔单抗和PBS组之间的标志性通路之间的异质性增加，尽管在最后两个细胞系中差异不显著(图4a，b)。使用EVA的异质性测量表明，在治疗过程中，异质性开始增加，作为对西妥昔单抗的直接反应。这种效应可能是由于同一细胞系中的不同细胞亚克隆正在激活不同的途径来克服EGFR抑制的事实。RNA速度分析比较处理和未处理的HNSCC细胞，证明西妥昔单抗诱导转录变化反映一个动态过程(图4c)。在所有三个被评估的细胞系中，未经处理的细胞(灰色)定向流向西妥昔单抗处理的细胞(红色)(图4d)。这些结果表明，在体外培养的HNSCC细胞中，由于EGFR活性的存在，HNSCC细胞将从大多数途径处于稳态状态(这里以未经处理的细胞为代表)，发展到不同的mRNAs上调的状态(以西妥昔单抗处理的细胞为代表)，以激活替代途径来克服EGFR抑制。

异质性测量和RNA速度分析表明，对西妥昔单抗短期暴露的瞬时反应是一个动态过程，并反映在整体转录变化中，以克服EGFR激活的缺失。

图4 西妥昔单抗对单细胞异质性和RNA速度的影响

4.2 TFAP2A在体外抑制HNSCC增殖的实验研究

TFAP2A作为一种转录因子，它能够调节几种生长因子受体(EGFR、HER2、TGFBR3、FGFR1、IGFR1和VEGF)的表达。JQ1是一种溴域抑制剂，有研究表明它可以延缓获得的西妥昔单抗耐药性。为了研究TFAP2A在体外HNSCC细胞增殖中的作用，采用siRNA方法进行了基因沉默，并测量了治疗后5天的生长速度。与亲本细胞系(图5b-d，黑色全线和虚线)相比，所有转染的细胞系的生长速度都较低。与SCC6相比，TFAP2A在SCC1和SCC25中的作用更为显著。这可能与两种细胞系在大多数细胞克隆中都表达TFAP2A有关。

西妥昔单抗治疗在没有TFAP2A(红色全线和虚线)的情况下增强了生长抑制作用，协同效应的效力取决于细胞系。而JQ1处理对增殖控制的影响更强(蓝色全线和虚线)，很可能是由于沉默了另一种增殖因子(c-Myc)和/或RTK。有趣的是，西妥昔单抗和JQ1的联合治疗并没有提供明显更强的协同效应(橙色全线和虚线)。

这些结果表明，在体外培养的HNSCC中，转录因子TFAP2A是细胞生长的重要调节因子。

图5 西妥昔单抗和JQ1单独或联合作用时对HNSCC细胞生长的影响

4.3 西妥昔单抗体外抑制HNSCC细胞迁移

为了探讨西妥昔单抗和JQ1在EMT通路中的作用，对SCC1、SCC6和SCC25细胞进行了单独或联合作用的划痕实验。与相应的未处理细胞相比，西妥昔单抗处理导致所有三种细胞系的细胞迁移受到抑制(图6b-d)。西妥昔单抗、JQ1或联合治疗对SCC1的迁移没有任何影响，与未处理的细胞相比，所有处理组的抑制作用都是相同的(图6b)。JQ1处理的SCC6细胞迁移速度比西妥昔单抗快，而联合治疗减少了迁移，但不如西妥昔单抗治疗有效(图6c)。虽然JQ1能够减少SCC1和SCC6的迁移，但对SCC25的迁移能力没有影响，细胞的迁移速度与未处理的细胞保持不变。西妥昔单抗抑制SCC25迁移的效果最强，联合用药也降低了运动能力(图6d)。转染siRNA后，HNSCC细胞迁移不受TFAP2A缺失的影响。转染TFAP2A siRNA的SCC1、SCC6和SCC25(图6e-g)表现出与未转染细胞系相同的迁移速率(图6b)。划痕实验观察表明，TFAP2A不直接调节EMT基因，因为转录因子的沉默不直接影响迁移。迁移的影响只与西妥昔单抗或JQ1疗法有关。图6 缺乏TFAP2A的细胞迁移及西妥昔单抗和JQ1治疗的影响

总结

总体而言，本文通过单细胞转录组+ATAC-seq+RNA-seq多组学联合分析研究表明，西妥昔单抗治疗引起的转录和染色质改变，是在获得性耐药性发展之前可以检测到的早期事件。重点研究了两条通路：TFAP2A和EMT，这两条通路被认为与西妥昔单抗和其他抗EGFR疗法的耐药有关。另一个重要发现是细胞间的异质性如何导致相同靶向治疗耐药机制的不同变化。分析结果表明要克服耐药性的获得，需要不止一种联合疗法。

百迈客是国内首批引进10x Genomics单细胞测序平台，使用Chromium系统采用先进的微流控、油滴包裹和barcode标记等技术实现一次性分离、高效标记捕获；同时具有10x 单细胞转录组、空间转录组、单细胞免疫组库、全长转录组测序，实现10x平台全面优质服务；已经具有大量单细胞分离捕获，极低量RNA反转录扩增建库成功经验；提供单细胞分离捕获、反转录建库、测序、标准分析和高级分析全套单细胞测序服务；强大的生信团队不仅提供基本分析，还提供细胞分化轨迹分析等多种高级分析；资深单细胞技术人员为您提供专业的课题方案设计，为您量身订造专属个性化多组学联合分析。百迈客医学科研服务事业部，是您值得信任和托付的团队，我们将竭诚为您服务，期待与各位老师在今后的日子携手合作，相信百迈客出品，必是精品。

文：Tanbn&Anna

排版：市场部

往期回顾：