【单细胞】 单细胞转录组与ATAC联合为“盲人”带来新曙光

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英文题目：Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration

发表杂志：science影响因子：41.845研究方法：RNA-Seq, ATAC-Seq and scRNA-Seq

研究背景

视网膜神经元的缺失是致盲的主要原因。虽然哺乳动物无法再生失去的视网膜神经元，但成年斑马鱼可以通过重新编码穆勒神经胶质，使其达到类似于神经源性祖先的状态，从而再生所有的视网膜神经元。相比之下，孵化后的鸡穆勒神经胶质细胞增殖对损伤的反应保留有限的神经原性能力，并产生少量的视网膜内神经元。在斑马鱼中，几个损伤诱导的穆勒神经胶质基因(如ascl1a)促进了神经生成能力及穆勒神经胶质细胞的再生。在小鼠中，强制表达穆勒胶质细胞中的Ascl1可以将这些细胞重新编码为有功能的视网膜内神经元，相反，抑制Hippo通路可以刺激损伤后小鼠的穆勒神经胶质细胞增殖，但不能诱导神经元再生。为了确定穆勒神经胶质细胞增殖和神经发生的遗传和表观遗传障碍，我们比较了具有不同再生能力的多种物种对视网膜损伤的分子反应。

 某些冷血动物的视网膜穆勒神经胶质细胞损伤可诱导神经元再生，但哺乳动物不能。为了确定将穆勒神经胶质细胞重新编码为祖细胞的基因调控网络，本文分析了斑马鱼、小鸡和小鼠在不同刺激的反应中穆勒神经胶质细胞的基因表达和染色质可及性的变化。确定了进化保守和物种特有的基因网络控制神经胶质的沉默，反应和神经再生。在斑马鱼和小鸡中，从静止过渡到反应是视网膜再生的必要条件，而在小鼠中，一个专用网络抑制神经再生并保持沉默状态，成年小鼠损伤后，核因子I (NFI)转录因子的破坏导致穆勒神经胶质细胞增殖和生成神经元的基因沉默。本文的研究确认了这些物种中穆勒神经胶质细胞对损伤反应的相似性和差异性，并揭示了哺乳动物穆勒神经胶质细胞抑制神经能力的机制。这些发现可能有助于修复退行性疾病造成的视网膜神经元丢失的治疗。

实验结果

1. 穆勒神经胶质细胞损伤调控基因的RNA-seq分析

• 为了确定控制小鼠和斑马鱼神经胶质细胞重编程的核心基因调控网络，本文研究了两种损伤模式:光损伤(视网膜外部损伤)和NMDA治疗(视网膜内损伤)。利用FACS在受伤后的多个时间点分离出穆勒神经胶质细胞构建了100个批量RNA-Seq文库和40个ATAC-Seq文库。对RNA-seq数据的主成分分析揭示了NMDA和光照损伤后转录变化的物种特异性模式。小鼠穆勒神经胶质细胞的转录变化在损伤后3小时内迅速发生，但又恢复到类似休息状态（图1A），然而，在斑马鱼中NMDA和光照损伤均导致穆勒神经胶质逐渐偏离静息状态（图1B）。

 图1.小鼠和斑马鱼神经胶质细胞的RNA-seq分析

小鼠（A）和斑马鱼（B）RNA-seq数据的主成分分析

• 我们在小鼠中发现2198个差异表达基因(DEGs)，在斑马鱼中发现1600个差异表达基因(DEGs)，这些差异表达基因在NMDA和光损伤中很常见。这些DEGs在斑马鱼和小鼠身上都显示了三组变化。第一组在静息状态下表达高，损伤后表达抑制（图1C,D）其余两组分别表现出快速和缓慢的损伤依赖诱导。基因本体论分析显示出不同物种间的差异。例如，快速诱导的小鼠穆勒神经胶质基因包括TNF、MAPK、NFKB和Hippo通路的成分（图1E）而在斑马鱼中，它们被富集用于核糖体生物生成（图1F）缓慢诱导的小鼠基因为核糖体生成发生富集，而在斑马鱼中，它们为细胞周期相关功能富集，反映了斑马鱼穆勒神经胶质在光损伤后25小时重新进入细胞周期的事实。

 图1.小鼠（C）和斑马鱼
（D）差异表达基因(DEGs)表达谱

小鼠（E）和斑马鱼（F）DEGs的功能

• 为了识别在穆勒神经胶质细胞中发生变化的物种特异性基因，包括候选神经源性调节因子，我们比较了斑马鱼和小鼠的DEGs，并将它们分为三类。其中有547个差异基因在其他物种中缺乏同源基因，2483个差异基因在两种物种中均有同源基因但有物种特异性变化，以及354个差异基因在两种物种中具有不同的损伤诱导变化模式。此外，还鉴定了368个基因，它们在小鼠和斑马鱼神经胶质细胞损伤后没有差异表达，但在基线表达上显示出显著差异。

2. 斑马鱼、鸡和小鼠视网膜的scRNA-seq分析

• 为了全面识别调控穆勒神经胶质细胞重编程的基因，我们在NMDA或光损伤后对小鼠、斑马鱼和鸡的视网膜进行了scRNA-seq，我们分析了77,924个小鼠细胞，85,051个小鸡细胞，105,666个斑马鱼细胞。同时用外源性因素治疗视网膜，这些外源性因素可以诱导不受损伤的重编程，例如：TNFα和γ分泌酶抑制剂（T+R）处理斑马鱼，FGF2和胰岛素(生长因子)处理小鸡，在小鼠身上进行了FGF2和胰岛素联合治疗NMDA，可诱导有限的增殖但不诱导神经元再生。scRNA-seq分析将细胞分离成不同的簇(图2,A到D)，并使用已知的视网膜细胞类型标记进行标注。我们确定了每个物种中所有主要的视网膜细胞类型，包括表达nr2e3和neurod1的斑马鱼棒状限制性祖细胞亚群。NMDA处理和光损伤后，Rod祖细胞分别有101个和195个差异表达基因，其中97%和92%的差异表达基因在穆勒神经胶质细胞损伤后也发生了变化，我们在这三个实验物种中均发现了休眠和激活的穆勒神经胶质细胞。相对于完好的视网膜，斑马鱼、鸡和小鼠的穆勒神经胶质细胞占视网膜细胞的比例分别为25.8%、38.2%和16.7%，也可能反映了细胞存活和捕获效率的偏差。

 图2. 鼠、鸡和斑马鱼视网膜的ScRNA-seq分析

A. NMDA处理后小鼠视网膜细胞的聚类分析

B. 小鼠视网膜细胞标志物的表达

C. NMDA或生长因子处理后鸡视网膜细胞的聚集

D. NMDA或生长因子处理后斑马鱼视网膜细胞的聚集

E. 细胞类型特异性标记基因。每一列表示一个单独的细胞类型

F. smFISH在斑马鱼、鸡和小鼠穆勒胶质细胞中显示Mlc1/ Mlc1/ Mlc1表达

最后，我们比较了三个物种的转录组，并确定了每种视网膜细胞类型的进化保守性和物种特异性标记基因（图2E）利用smfISH，我们证实了Mlc1/ Mlc1/ Mlc1和Inhba/ Inhba/ inhbab在三个物种的穆勒神经胶质细胞中选择性表达，而Cav2/ Cav2在小鼠和斑马鱼穆勒神经胶质细胞中选择性表达（图2F）。

 3. 穆勒神经胶质细胞的重编程的轨迹分析

使用scRNA-seq数据对穆勒神经胶质细胞进行了轨迹分析,与批量RNA-seq数据一致，小鼠穆勒胶质细胞在NMDA和光照损伤后，基因表达迅速变化，然后逐渐恢复到静息状态（图3A,B）相比之下，斑马鱼穆勒神经胶质细胞表现出渐进性的损伤诱导的转录变化（图3C）T+R治疗引起类似两种损伤的基因表达变化在斑马鱼中，观察到损伤和T+R治疗后都有一个侧枝（图3C）其中与反应状态相关的基因如manf富集，而主要分支显示与神经发生/增殖相关的基因表达增加,如ascl1a和pcna.RNA速度分析表明，经过NMDA处理，穆勒神经胶质细胞从静止状态过渡到反应状态，然后进入增殖状态或恢复到静止状态，在小鸡实验组也观察到了类似的现象（图3D）。此外，我们计算了不同物种损伤后穆勒神经胶质细胞基因表达谱的差异。我们观察到小鼠和斑马鱼的静息和激活的穆勒神经胶质细胞是相似的，斑马鱼和小鸡的增殖的穆勒神经胶质细胞是相似的。这些表明，小鸡和斑马鱼神经胶质细胞在重新编程之前通过反应状态进行了重新编程。 

图3.老鼠、小鸡和斑马鱼神经胶质的轨迹分析

A. NMDA处理小鼠穆勒神经胶质细胞（MG）的运动轨迹，插入图为MG的GF、生长因子(FGF2+胰岛素)治疗拟时间分析

B. 小鼠MG在拟时间分析中的定量

C. NMDA处理后斑马鱼MG的运动轨迹

D. NMDA处理后鸡MG的运动轨迹

4. 重编程与正常发育的斑马鱼穆勒神经胶质细胞对比

 为了确定穆勒胶质细胞来源的祖细胞是否在转录上类似于正常视网膜发育过程中观察到的祖细胞，我们将斑马鱼视网膜发育过程中与重新编程的穆勒胶质细胞的scRNA-seq数据进行了比较。在发育中的斑马鱼视网膜中发现了两种不同的视网膜祖细胞(RPC)：原发和神经源性视网膜祖细胞（图4ABC），结合所有的RPC和穆勒神经胶质细胞，进行了轨迹分析。

图4. A.B.C.斑马鱼视网膜细胞的集群发育

NMDA、光损伤和T+R处理均诱导穆勒胶质细胞进入类似于多能RPC的状态，但也诱导了一个由反应性穆勒胶质细胞组成的分支（图4D）。在发育过程和随后的重编程过程中，差异表达的基因之间可以观察到显著的重叠，大部分重叠基因(83.8%)在发育和NMDA处理之间呈负相关，发育基因如ascl1a减少，在重编程穆勒胶质细胞中表达增加，反之亦然（图4E）。这些结果表明，在首次通过反应状态后，穆勒胶质细胞通过逆转与胶质细胞形成相关的基因表达的时间模式，重新编程。

图4.D 视网膜祖细胞(RPC)和MG在斑马鱼发育和NMDA处理后的轨迹

E. DEGs及NMDA处理的MG的拟时间表达图谱

5. 控制穆勒神经胶质细胞重编程的基因调控网络

为了分析穆勒神经胶质细胞中染色质可及性的变化，我们在斑马鱼和小鼠损伤后进行了ATAC-seq分析，我们从NMDA和光照损伤样本中鉴定了差异可达染色质区域(DARs)，DARs来自启动子区、内含子区和基因间区，其中小鼠和斑马鱼分别占96%和90%（图5ABC）。染色质可达性的变化与基因表达的变化相关，同时也观察到损伤后染色质可及性的物种特异性的改变。通过整合基因表达和染色质可达性数据，重建控制穆勒胶质细胞重编程的基因调控网络，我们开发了一种称为方法综合管制网络分析，整合了斑马鱼和小鼠的大容量和单细胞RNA-seq数据，获得了10个DEGs和Muller glia表达的转录因子模块，同时，我们分析了ATAC-seq数据，以识别用于推断转录因子和之间的调控关系的差异可及足迹。我们为每个模块构建了一个完整的基因调控网络，并生成了斑马鱼和小鼠的细胞内调控网络。

图5.从ATAC-Seq分析识别不同的可及区域

A. 斑马鱼和小鼠在NMDA处理和光损伤(LD)后差异可及区域(DARs)的维恩图

B. NMDA与光损伤的DAR相关性分布  
C.五种相关DARs的分数

6. 调控穆勒神经胶质细胞重编程基因的验证

为了选择功能分析的候选基因，检查了调控网络中每个基因的相关性，以及穆勒神经胶质细胞重编程期间基因表达的变化。测试了调控反应性的转录因子是否需要在斑马鱼的穆勒神经胶质细胞中重编程及反应状态下诱导的yap1。所有减少穆勒神经胶质细胞增殖的处理也抑制了光感受器的再生，在杆状体和红、蓝锥体中都可以看到显著的减少。另外，hmga1a突变体及维替泊芬-处理视网膜组的单细胞测序显示，增殖的穆勒胶质细胞减少，反应性穆勒胶质细胞相应增加。

实验结论

本研究发现，三种动物的穆勒神经胶质细胞在受伤后都进入了反应状态，在此状态下，小鼠的穆勒神经胶质细胞在恢复平静之前会停止活动。而在斑马鱼，和小鸡中大多数反应性穆勒神经胶质，通过这种状态成为祖细胞。hmga1a和yap1功能的丧失破坏了从反应状态到祖细胞状态的转变，而FABP通过抑制从静息状态到反应状态的转变来阻断重编程，其中一些基因，包括yap1，调节脊髓的神经元再生能力，提示这些相同的机制可能广泛地调节中枢神经系统再生。

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文：荒慌

排版：市场部

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