Science |单细胞+T细胞免疫组揭示胸腺细胞的发育轨迹

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文章导读

胸腺是T细胞发育和T细胞受体(TCR)库形成的关键器官，它塑造了适应性免疫的格局。T细胞在胸腺的发育是空间协调的，这一过程是由不同类型的细胞组成的胸腺微环境。虽然胸腺已被广泛研究使用不同的动物模型，但人们对详细的人胸腺图谱知之甚少，而且人类免疫治疗需要加深对胸腺细胞图谱的了解。

研究方法

本文为了提供一个全面的胸腺细胞生命图谱，作者使用从人胸腺中分离出来的细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。采集了在怀孕后7周到17周之间15个的胚胎和胎儿发育阶段的胸腺，以及9个儿童和成人的产后胸腺。采用了不同的分类方案，以增加代表性不足的细胞群体的覆盖率。利用从单细胞转录组中获得的标记基因，通过单分子荧光原位杂交(smFISH)对细胞状态进行了空间定位。提供人类与小鼠之间的系统比较，也生成了出生后小鼠胸腺的单细胞数据并将其结合现有的小鼠数据集进行综合分析。最后，富集了TCR序列用于单细胞文库生成，通过T细胞免疫组库测序研究人类TCR序列重组和选择的偏倚性。

研究结论

使用单细胞RNA测序表征了整个生命周期中人类胸腺的全面细胞图谱，并重建T细胞分化轨迹和T细胞受体（TCR）重组动力学，并结合T细胞免疫组库分析提供了有关人类T细胞发育的新见解。

英文题目：A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation

发表期刊：Science

影响因子：41.845

DOI:10.1126/science.aay3224

材料与方法

材料：15个胎儿或胚胎发育期胸腺组织；8000 个CD45⁺ or CD45^–胸腺单细胞；

方法：10x 单细胞转录组&免疫组库测序；

研究结果

1. 单细胞转录组鉴定胸腺细胞的组成

文中通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）检测了15个在妊娠7周(胸腺雏形可被解剖)至17周(胸腺发育完全)期间的胸腺细胞，同时还分析了9个产后胸腺样本。从发育中的胸腺中获得了138,397个细胞，从出生后的胸腺中获得了117,504个细胞。通过单细胞转录组特定标记基因的表达将细胞簇注释为40多种不同的细胞类型或细胞状态。不同类型的T细胞在数据集中表现良好，包括双阴性(DN)、双阳性(DP)、CD4 +单阳性(CD4 +)、CD8 +单阳性(CD8 +)、FOXP3 +调节性(T reg)、CD8aa +和 γδ链T细胞。我们还鉴定了其他免疫细胞，包括B细胞、自然杀伤细胞(NK)、固有淋巴样细胞(ILCs)、巨噬细胞、单核细胞和DCs。DCs可进一步分为髓系/常规DC1、DC2和浆细胞样DC (pDC)。

图1. 整个生命周期人胸腺细胞组成的鉴定

作者对数据进一步分析构成胸腺微环境的非免疫类型细胞的不同特征，可以将其分为多个亚型，包括胸腺上皮细胞（TECs）、成纤维细胞、血管平滑肌细胞(VSMCs)、内脏内细胞和淋巴管内皮细胞。并通过RNA smFISH实验验证COLEC11、FBN1、PDGFRA、CDH5、ACTA2、GDF10、 ALDH1A2、MYOD1、NEUROG1、EPCAM标记基因的表达，这些结果与单细胞转录组表达一致。同时本文还分析了导致先天性T细胞缺失的基因的表达模式，从而揭示了这些罕见疾病基因在胸腺发育过程中可能在何时何地发挥作用。

图2. 胸腺基质细胞类型特定标记基因表达

2.常规T细胞的分化轨迹

由于胎儿肝脏是胸腺雏形发育时的主要造血器官和造血干细胞和多能祖细胞(HSCs/MPPs)的来源，作者这里对同一胎儿的成对胸腺和肝脏进行了分析。合并胸腺和肝脏数据发现早期胸腺祖细胞（ETPs）定位于胎儿肝多潜能祖细胞（HSCs/MPPs）和pre/pro-B细胞之间。而作者定义的肝/胸腺造血祖细胞亚群与从骨髓中分离的人造血祖细胞的单细胞转录组整合发现ETPs定位在来自骨细胞的多淋巴祖细胞(MLP)和胎儿肝脏的早期淋巴祖细胞旁。

为了研究下游T细胞分化轨迹，我们选择T细胞群，并使用UMAP和力定向图分析对其进行投影，显示了T细胞分化的连续轨迹。为了验证这一轨迹的有效性，研究T细胞分化的标志基因:CD4/CD8A/ CD8B基因、细胞周期(CDK1)和重组(RAG1)基因，并完全重组了TCRαs/TCRβs。该轨迹显示T细胞从CD4^- CD8^- DN细胞开始，逐渐表达成CD4⁺和CD8⁺ DP细胞，然后通过CCR9^high Tαβ阶段，分化为成熟的CD4 ⁺或CD8 ⁺ SP细胞。DN和DP细胞周期基因的表达将细胞分为两个阶段。将具有较强细胞周期特征的早期群体指定为增殖(P)和增殖后期种群处于静止状态(Q)。重组基因(RAG1和RAG2）的表达从增殖期开始增加，在静止期达到高峰。

通过T细胞TCR免疫组库分析TCR重组与T细胞分化轨迹，在DN期，重组的TCRβ序列从P期晚期开始，这与重组特征的增加和pre-TCR α(PTCRA)的表达相吻合。TCRβ的非生产性重组事件与生产性重组事件(非生产性评分)在DN期相对较高，在细胞进入DP期时降至基础水平，表明了beta选择的影响。值得注意的是，TCRβ的非生产性评分在DN(Q)阶段最高，这表明细胞不能对第一个等位基因进行有效的TCRβ重组，就会对另一个等位基因进行重组。在DP阶段，从P阶段开始就检测到重组的TCRa链。与TCRβ相比，非生产性TCRa链在DP(Q)细胞中没有富集。而进一步转录组与数据库蛋白组联合分析，发现DN(P)、DN(Q)和DP(P)分期分别与CD34 ⁺ CD1A ⁺、ISP CD4 ⁺和DP CD3密切匹配。

图3. TCR重组和胸腺T细胞分化轨迹

3.胸腺髓质GNG4⁺ CD8αα T细胞的特征

在鉴定了非常规T细胞及其在胸腺T细胞发育中的起源轨迹后，作者还重点研究了新鉴定的GNG4⁺ CD8αα⁺ T(I)细胞，因为它们具有独特的基因表达谱(GNG4、CREB3L3和CD72)。这与CD8αα⁺ T(II)细胞形成对比，后者表达已知的CD8αα⁺  T细胞标记，如ZNF683和MME(53)。此外，作为胸腺迁移调节因子的KLF2在CD8αα⁺  T(I)细胞中表达水平极低，提示它们可能是胸腺栖居细胞。为了在原位定位和验证CD8αα⁺  T(I)细胞，我们在胎儿胸腺组织切片中形成靶向GNG4的RNA smFISH。GNG4 RNA探针鉴定了胸腺髓质中富集的一组不同的细胞，并与CD8A RNA共定位。TNFRSF9 (CD137)是CD8αα⁺  T(I)细胞和T regs共享的标记。在原位测试时，GNG4 ⁺细胞是TNFRSF9 ⁺细胞的一个子集，进一步证实了定位模式的有效性。比较小鼠个人胸腺细胞图谱，发现人体内的GNG4 ⁺ CD8αα⁺ T(I)细胞与小鼠上皮内淋巴细胞前体细胞A型最为相似，都表达HIVEP3、NR4A3、PDCD1和TNFRSF9。

图4. 胸腺髓质中GNG4 ⁺ CD8αα T细胞的鉴定

4.DCs富集和激活介导胸腺的发育选择

T细胞的选择是由特殊的胸腺上皮细胞（TECs）和抗原递呈的树突状细胞(DCs)协调的。这里重新鉴定了三种特征明显的胸腺DC亚型:DC1(XCR1⁺ CLEC9A⁺)、DC2(SIRPA ⁺ CLEC10A ⁺)和pDC (IL3RA ⁺ CLEC4C ⁺)。我们还鉴定了一个新的DC群体-活化DCs (aDCs)，其特征是LAMP3和CCR7的表达，并通过原位试验检测aDCs表达高水平的趋化因子和共刺激分子，以及转录因子，如AIRE和FOXD4，结果表明，它们可能与之前在人类扁桃体和胸腺中描述的AIRE ⁺ CCR7 ⁺ DCs相关。而单细胞转录组数据进一步分析，在aDC组中，通过不同的基因表达谱可以识别出三个亚群:aDC1、aDC2和aDC3。通过总标记基因的表达，发现aDC1-DC1和aDC2-DC2对之间存在明显的关系，说明每个aDC亚型都来自于不同的DC群体。值得一提的是，aDC1和aDC2的趋化因子表达模式不同，提示aDC的功能多样化。此外，aDC3细胞还降低了主要组织相容性复合体(MHC)的分类和协同刺激分子的表达。由于趋化因子介导的抗原呈递细胞和T细胞之间的相互作用，即可调控的细胞迁移和解剖的共定位。实验证明CD8αα⁺ T(I)细胞在髓周区域的位置提示，CD8αα⁺ T(I)细胞的信号有可能在髓质区招募XCR1⁺ DC1细胞，这些细胞在髓质区被激活并上调CCR7。 

图5. 树突状细胞DC的募集和激活介导胸腺发育

5.T细胞免疫组库的形成和偏倚

文中还研究了T细胞免疫组库分析，作者利用单细胞免疫组库测序从单细胞高分率水平获全长TCR V(D)J基因序列，这为研究TCR重组的动力学提供了机会。建库是从5’端获取免疫组库序列信息，并加上注释和全长序列，更加有利于分析TCR序列的形成和选择模式。 

图6. TCR序列表达染色体位置分布热图分析

如图所示，TCR的β链VDJ基因使用存在较强的偏向性，从重组起始(DN细胞)一直持续到成熟T细胞期。这种偏差不能用重组信号序列(RSS)评分来解释。这种偏差确实与基因组位置很好地相关，这也与基因座的环状结构是一致的，在小鼠中已经观察到。然而，我们在人类身上观察到的V基因使用偏差在小鼠身上却没有发现；还观察到D2基因优先与J2基因结合，而D1基因可以与J1和J2基因以相似的频率重组。TCRβ、V-D和V-J对之间没有明显的关联，同时单细胞免疫组库还精准匹配TCRα链和TCRβ链。

为了探究不同细胞类型之间是否存在差异TCR库偏倚，我们通过主成分分析比较了不同细胞类型的TCR免疫组库。值得注意的是，我们观察到CD8 ⁺细胞和其他细胞类型的明显分离。这一趋势在所有个体供体样本中是一致的。通过对优势克隆序列差异的统计检验，发现了几个TCR基因导致了这种现象。观察到的趋势与从外周血中分离的初始CD4⁺ /CD8 ⁺ T细胞相似。相反，相对于细胞类型，CD8⁺ T细胞的TRAV- TRAJ库倾向于远端V-J对。考虑到在TCRα链逐步重组的后期会产生DC，这可能是由于对CD8 ⁺ T谱系的更慢或更低效的。CD8αα⁺ T(I)细胞也有轻微的偏近V-J对，这在产后胸腺样本中比胎儿样本更明显。

图7. T细胞免疫组库揭示T细胞分化轨迹分析

总结

本文通过单细胞转录组&免疫组库检测，结合TCR库信息重建了人类常规和非常规T细胞分化的轨迹，发现成熟常规T细胞的TCR库存在偏倚，因为TCR序列偏倚解释了抗原肽链pMHC组合的多样性，可能对如何应对抗原反应挑战有深远的影响。作者对胸腺微环境的分析揭示了胸腺组成细胞类型的复杂性，以及间质细胞和先天免疫细胞之间相互作用以协调胸腺的发展和支持T细胞的分化。胸腺细胞和支持移植细胞之间的细胞间通讯网络可用于增强体外培养系统生成T细胞，为未来的细胞治疗工程策略和肿瘤免疫治疗提供了应用前景和方向。

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文：驷说

排版：市场部

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