单细胞多组学|Nature带你玩转单细胞表观基因组学探讨人类皮质发育的机制

哺乳动物生长发育过程一直是一个经典的话题，随着单细胞技术发展，单细胞转录组研究揭示哺乳动物大脑皮层细胞的异质性，但是对于表观调控研究还未深入。为了在单细胞水平研究转录组和表观调控的关系，百迈客可以提供单细胞多组学ATAC&基因表达检测（scATAC&GEX-seq），真实反映同一个细胞内表观调控与基因表达内在联系，确定假定的调控元件（启动子，调节因子）和它们的靶基因之间的联系。此外百迈客业务还包括单细胞转录组、空间转录组、、单细胞免疫组库等，有兴趣的老师可以联系当地销售。接下来我们看看最新Nature发表单细胞水平表观基因组学研究思路，文章详情如下：

发表期刊：Nature

影响因子：49.962

原文链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34616060

发表日期：2021-10-06

摘要

在哺乳动物发育过程中，染色质状态的差异与细胞分化相一致，反映了基因调控图谱的变化。在大脑发育过程中，细胞命运和图谱特征对于定义细胞特征和赋予神经发育障碍选择脆弱性非常重要。为了确定发育中人脑的特定细胞类型的染色质可及性模式，作者使用了一种单细胞转座酶可及性测序分析方法(scATAC-seq)，对来自人前脑的原始组织样本进行了测序分析。应用无偏估计来识别在神经形成过程中经历了广泛的细胞类型和大脑区域特异性可及性变化的基因组位点，并应用综合分析来预测特定细胞类型的候选调控元件。结果发现，脑类器官包含了大多数假定的细胞类型特异性增强子可及性模式，但缺乏许多体内发现的细胞类型特异性开放染色质区域。对脑区域染色质可及性进行系统比较，发现了大脑皮层神经前体细胞之间出人意料的差异，表明视黄酸信号在前额叶皮质神经元谱系确定中起着重要作用。总之，结果揭示了染色质状态对细胞类型多样性和细胞命运特异性的发展模式具有重要作用，并评估了脑类器官作为皮层发育模型的精确度和稳定性。

背景介绍

大脑皮层的细胞类型通常是根据少数形态学、解剖学和生理学特征进行分类的(图1)。新兴的单细胞转录学，包括single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)，已经能够大规模平行分析单个细胞的数千个分子特征，并揭示了密切相关的细胞类型之间的差异，例如位于大脑皮层不同区域的兴奋性神经元。尽管取得了一些进展，但人大脑皮层中出现不同神经元谱系的发育机制仍然基本未知。

染色质状态通过调节基因调控元件(如增强子)的可及性来确定基因组的功能结构，这些元件是转录调节因子的结合位点。在发育过程中，转录因子的顺序级联逐渐重塑，并且不同细胞类型呈现出染色质可及性的差异化。尽管染色质的可及性是细胞特性的一个基本特征，但关于大脑发育过程中染色质状态变化的研究相对较少。目前单细胞基因组学已经能够使用scATAC-seq以细胞分辨率对染色质状态进行可伸缩分析。在发育中的小鼠大脑中，scATAC-seq揭示了作为神经发育过程基础的染色质可及性的高度动态变化。有必要将这些研究扩展到人类初级组织，以便更好地了解非编码调控元件(包括人类特有的神经发育增强子)的突变如何干扰正常的发育过程，并导致精神神经发育障碍的遗传基础。

图1：发育中皮质的横截面示意图，显示了主要细胞类型。

发育中大脑的染色质状态

为了在单细胞分辨率下观察发育中人脑的染色质状态，作者对6例妊娠中期的人前脑进行了scATAC-seq，包括背外侧前额叶皮层(PFC)、初级视觉皮质(V1)、初级运动皮质(M1)、初级躯体感觉皮层、背外侧顶叶皮质、颞叶皮质、岛叶皮质和内侧神经节隆起(MGE)。共有77,354个细胞通过质控进行下游分析。scATAC数据库的聚类结果与并行产生的混合ATAC-seq测序的数据高度相关，并且生物学重复之间的相关性系数也很高。对数据进行了降维处理与批次效应校正。使用Leiden群落检测算法识别了25个不同的clusters。有力地鉴定了皮质和皮质下(MGE)两种不同的细胞类型。

图2实验流程与scATAC-seq细胞的细胞类型

使用基因活性分数来区分细胞类型，鉴定了多种主要的细胞类型，包括放射状胶质细胞(RGS)、中间前体细胞(IPC)、深层(皮质V-VI层)兴奋性神经元(dlENs)、上层(皮质II-IV层)兴奋性神经元(UlENs)、MGE和CGE来源的皮质中间神经元(分别为IN-MGES和IN-CGES)、胰岛神经元、MGE的前体细胞、小神经胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）、内皮细胞以及壁细胞。此外，结合scRNA-seq数据，使用CellWalker将scATAC-seq细胞与细胞类型匹配。CellWalker以更精细的分辨率识别细胞类型和更广泛的细胞亚型。此外，作者可以在两种亚型(TRGS和ORGS)之间识别出不同的开放区，这两种亚型分别表达CRYAB和HOPX，这表明scATAC-seq能够在高分辨率下区分细胞亚型，具有更高的灵敏度。

图3细胞类型标记基因的特异性

识别特定细胞类型的增强子

为了确定候选的基因调控元件，从每种细胞类别中找出总的单个细胞的开放区。将重叠的开放区合并，总计459,953个开放区。对基因组中开放区进行注释，其在基因内含子和远端基因间隔区以及转录起始点附近区域富集。将开放区与Roadmap Epicenomics 25-state chromatin model相交，发现启动子和增强子state强烈富集，以及转录、异染色质和静止state的耗尽。每种细胞类型确定了特定于细胞类型的差异可及的开放区，共有265,123个开放区，大多数细胞类型具有数千个特异的开放区。此外，还确定了八个大脑区域之间可区别访问的开放区信号值。

为了鉴定候选增强子，整合了ATAC-seq、CUT&Tag、Hic和基因表达数据，并使用接触活性算法来预测所有类型的皮质细胞的增强子-基因相互作用。共预测了25,659个基因连锁增强子。其中在发育中的人皮层分离的细胞上进行了染色质免疫沉淀和测序(PLAC-seq)，发现了67,493个开放区以及10,050个预测的增强子，这些开放区和预测的增强子与预测的细胞类型特异性增强子相关的基因被富集。为了进一步验证注释的准确性，将开放区与从人类皮质组织样本生成的公开可用数据进行关联分析。发现scATAC-seq鉴定到了混合测序数据注释的大多数开放区，并且还鉴定了许多在混合数据中未预测的细胞类型特异性peaks，特别是富集在诸如小神经胶质细胞和内皮细胞的稀有细胞群体中的开放区。在功能验证的前脑增强子中，大多数(319个中的304个)与染色质可及性开放区重叠，但只有67个重叠的增强子是通过激活接触方法进行预测。总之，这些分析表明，scATAC-seq是一种从异质组织样本中检测染色质可及性模式的可靠方法。然而，预测的增强子与以前发表的研究的有限重叠表明，迫切需要更好地理解预测调控潜力的计算机算法的相关特征。

为了确定细胞类型的调节“语法”，计算了已知的转录因子结合基序在细胞类型特异的开放区中的富集。转录因子基序的富集与标记基因富集的细胞类型注释密切相关。为了在单细胞水平上检查转录因子基序的富集，作者还使用了ChromVAR(方法)，发现每个cluster的排列靠前的基序富集基本一致。这些发现确定了scATAC-seq在不同细胞类型中识别出与已知转录因子表达模式一致的染色质可及性模式，并为发现细胞图谱和细胞命运的转录因子编码提供了路径。 

图4 不同细胞类型、原始scATAC-seq细胞中每个区域的特异性peaks以及预测增强子-基因相互作用

调控区突变引发的疾病风险

不同发育阶段和分化状态的染色质状态的细胞分辨率数据可能提供突变和发育中的不同细胞类型选择性脆弱性之间的联系。为此，研究者将特定细胞类型的ATAC-seq peaks和预测的增强子与疾病相关的常见和罕见的非编码突变体记性关联分析。首先分析了细胞类型特异性的peaks sets、预测的增强子、启动子相互作用区域与基因组区域重叠的peaks值，这些区域在发育迟缓的个体中富集了拷贝数变异；结果发现dlEN、内皮/壁层和小神经胶质细胞特异性peaks显著富集，以及中间神经元中重叠启动子相互作用区的peaks显著富集。

由于这些区域不提供针对单个调控元件或基因的特异性，所以又测试了特定细胞类型的peaks、预测的增强子以及与ASD、神经发育延迟(NDD)相关基因附近区域的启动子相互作用区域重叠peaks的富集情况，并发现在大多数细胞类型中这些区域显著富集或缺失。还对ASD和NDD患者的细胞类型特异性peaks和预测的DNMs的增强子进行了比较分析；但与同胞家系相比，在先证者中注释的DNMs没有显著富集。此外，将预测的增强子与包含神经发育疾病相关基因的拓扑结构域(TADS)相交，发现在几种细胞类型的TADS中有显著的共定位。

最后，研究者评估了在预测的每种细胞类型的增强子中与神经精神疾病风险相关的常见变异的富集程度。对精神分裂症、ASD、重度抑郁症和双相情感障碍进行了部分遗传连锁不平衡(LD)回归分析。结果发现，与精神分裂症相关的常见突变的兴奋性和抑制性神经元增强子富集。总而言之，细胞类型特异性染色质状态数据有可能在皮质发育过程中确定特定的调控程序，这些程序很有可能导致神经发育障碍，特别是提高的疾病相关的突变。

图5：scATAC-seq peaks中疾病相关变异的富集和耗尽

神经发生中染色质的动态变化

为了更好地理解转录组和表观基因组变化如何在神经发生过程调节细胞命运，联合分析了来自视觉皮质的相关细胞类型的scRNA-seq和scATAC-seq数据。基因表达和基因活性在共嵌空间的预测显示，不同细胞类型分群不受特征模式的影响。为了确定兴奋性神经元分化和成熟后的染色质可及性轨迹，在共嵌空间对细胞进行了拟时间排序，恢复了已知的兴奋性神经元分化的细胞类型的发育序列。发现了超过25000个开放区，在拟时间内具有瞬时可及性，包括超过5000个预测的增强子，其中许多与细胞类型识别相关的基因相互作用。

图6：人脑皮层神经发生过程中染色质可及性的动态变化

区域特异性染色质状态

在神经发生的早期，出现了特定区域类型的皮质兴奋性神经元，但在不同区域的前体细胞之间只发现了有限的转录差异。调控元件的可及性变化通常先于基因表达。研究者比较了头-尾轴两端、PFC和V1的兴奋性谱系细胞的scRNA-seq和scATAC-seq图谱。在每种模式中，对细胞进行拟时间分析，确定分化轨迹，并沿着该轨迹确定PFC和V1谱系之间转录或染色质状态差异变得明显的“分支点”。与转录组数据揭示了兴奋性神经元的区域特异性分群不同的是，染色质状态特征表明PFC和V1中间前体细胞群体之间存在显著差异。在转录水平上，PFC和V1IPCs只有少数几个基因有差异表达，而染色质可及性分析发现这些细胞类型之间有1800多个差异可及区。

为了确定可能导致PFC和V1谱系分化的调控程序，又对PFC和V1细胞之间可区分的开放区进行了转录因子结合位点富集分析。该分析鉴定了几个转录组研究预测的转录因子。该分析还在PFC细胞中发现了视黄酸(RA)信号通路的组成部分——在妊娠中期的PFC中RA活性增加。

图7：祖细胞染色质状态的区域差异预示着区域特异性兴奋神经元的出现

视黄酸在大脑皮层区域化中的作用

在哺乳动物大脑发育的过程中，视黄酸信号在神经组织中发挥着重要的作用。为了测试RA是否促进人类PFC的分化，在含有或不含有维生素A(RA合成的前体)的情况下培养皮质类器官。同时利用DEAB(一种有效的RA合成抑制剂)处理与维生素A一起培养的脑类器官。在分化的第10周，此时深层神经正在发生，利用scRNA-seq分析了脑类器官。发现在维生素A存在下培养的兴奋性前脑神经元与不含维生素A或在DEAB存在下培养的脑类器官的神经元是分开聚类的。还发现了区分PFC和V1皮层神经元的信号。利用目前的分类方法注释类器官神经元中的PFC和V1神经元的特征；与未使用维生素A培养或使用DEAB处理的神经元相比，维生素A培养的类器官中PFC类似神经元的比例始终较高。免疫染色证实了基因产物的差异表达，并发现与含有维生素A培养的脑类器官的PFC特性一致。这些发现表明，RA信号通路有助于人类皮质发育过程中PFC神经元谱系的发育。

图8：视黄酸在发育中的皮质PFC-V1分裂的作用

基准测试脑类脑类器官

由于人体原代组织比较稀缺，对人类神经发育的研究需要合适的体外模型，如脑类器官。之前单细胞转录组学和整体表观基因组学强调了大脑类器官细胞与体内同类细胞之间的相似性。利用三个遗传正常的样本在三个分化时间点的23,555个皮质类器官细胞进行了scATAC-seq。为了验证所产生的细胞系，从来自同一细胞系的类器官中生成了scRNA-seq数据，并进行了平行培养，结果表明所有细胞系都表达FOXG1和主要细胞类型的标记。scATAC-seq数据中确定了主要的细胞类型，但是单个分群包含的细胞类型特异性开放区比来自原代细胞少。随后，通过从原代细胞的开放区量化了类器官细胞之间的染色质可及性。在原代细胞中共确定了459,953个开放区，然而在类器官只确定了239,661个开放区。随后又发现在类器官中未检测到包括小胶质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞和OPCs等细胞类型的特定开放区。当从分析中去除这些开放区的peaks信号后，在类器官开放区中尚未发现V1兴奋神经元富集。然而，除了小胶质细胞增强子外，大多数(超过80%)的预测增强子都存在于类器官中。还鉴定了在原始细胞中没有发现的109,960个类器官开放区。

图9：脑类器官和原代组织的peaks比较揭示染色质图谱的显著差异

讨论

在这项研究中，分析了发育中的人脑中单个细胞的染色质状态，并发现了数千个追踪神经元分化的瞬时可及位点。这些状态可能揭示了在神经发生过程中控制细胞命运建立的机制，将它们与来自成人大脑的数据关联分析，可能使表观基因组神经发育轨迹的完全重建成为可能。与以前的研究一致，与疾病变异相关的染色质与神经精神障碍发病中的有丝分裂期后发育的皮质兴奋性神经元相关。未来需要探索这些调控区域中的疾病相关变异如何改变发育中的皮层中的细胞命运。通过比较发育过程中不同皮层区域(V1和PFC)的调控情况，发现了不同的转录因子结合位点，它们在这两个谱系之间存在差异富集。该结果扩展了RA信号在前脑发育中的作用，表明RA信号有助于人类PFC兴奋性神经元的发育。RA信号调节失调与一系列神经发育和精神疾病有关，因此该研究结果可能促进对这些疾病的研究。

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排版：市场部

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