Nature | 窥探细胞穿孔的秘密：GSDMB孔道形成与IpaH7.8作用机制
Journal Club
汇聚思想，点燃新识
Journal Club 凝聚了一批热爱科学、享受科学、传播科学的探索者和发现者。他们志同道合，他们青春飞扬，他们与科学共舞。在这里，你可以收获最新、最真的行业资讯和来自科研一线的文献解读。你关心的就是我们要说的，我们将用最质朴、最客观的文字书写有深度、有温度的科学。Journal Club，与你畅游Journal世界，和你共享科学蔚蓝。
作为细胞焦亡的执行者，gasdermin (GSDM) 由N端孔道形成结构域 (GSDM-N)、C端自抑制结构域 (GSDM-C) 以及连接这两部分的linker组成1。GSDMB (gasdermin B) 存在多种剪切异构体，其中，异构体1、4、6均含有经典的linker，连接GSDM-N和GSDM-C，而异构体2、3的linker存在不同程度的截短，异构体5则只含有C端结构域2。
有研究发现，GSDMB能够靶向细菌的细胞膜并对细菌的生长和播散发挥制约作用3，然而这一机制却对福氏志贺菌 (导致痢疾的病原菌) 无效，这一现象的发生与福氏志贺菌分泌的效应蛋白IpaH7.8密切相关4。除了GSDMB之外，IpaH7.8也能够与GSDMD结合，然而IpaH7.8识别并结合GSDMB和GSDMD的机制并不清楚。此外，GSDMB诱导细胞焦亡的能力在领域内一直存在一定争议，对GSDMB与其他GSDM截然不同的特性，目前也暂未有较好的解释。
2023年3月29日，Nature杂志在线发表了两篇文章，对GSDMB在细胞膜上形成孔道的机制以及IpaH7.8抑制GSDMB的机理进行了深入的阐述，其中一篇已在前期的推送中进行介绍。标题为Structural basis for GSDMB pore formation and its targeting by IpaH7.8的一篇由来自康涅狄克大学健康中心的阮建彬团队发表。通过解析GSDMB与IpaH7.8复合物以及GSDMB孔道的冷冻电镜结构，研究者将GSDMB中3个带负电的氨基酸残基所组成的基序确定为IpaH7.8识别的决定性因素。此外，GSDMB孔道的结构表明其可变剪接导致的不同长度的linker对其孔道形成能力发挥重要的调节作用。
在本文解析的GSDMB (isoform 1) 与IpaH7.8复合物的冷冻电镜结构中，可见IpaH7.8-LRR结构域与GSDMB-N以1:1的化学计量比结合，整体分辨率为3.8 Å。IpaH7.8-LRR结构域形成螺线管结构，由九个LRR结构组成，N端为2个α螺旋（α1和α2），C端含有α4螺旋以及一个平行的β10 (图1,b,c)。GSDMB形成了一种类似于GSDMA3和GSDMD的自抑制构象，α4螺旋从GSDMB-N延伸向外，从而与GSDMB-C相接触，而GSDMB-C通过一个由α9、α10和α12螺旋组成的巨大的疏水沟槽容纳突出的GSDMB-N α4螺旋 (图1,e,f)。
图1. GSDMB (isoform 1) 与IpaH7.8复合物的冷冻电镜结构
IpaH7.8的9个LRR中有6个与GSDMB的N末端相互作用，接触面积达约1826 Å2，关键的互作区域可分为I和II两个：IpaH7.8的LRR7-LRR9与GSDMB-N中含有负电荷残基的α1–β1’环形成第I区域，而IpaH7.8的LRR4-6与GSDMB ED1 (the first extension domain)中β3链相互作用形成第II区域。第I区域中的互作主要由极性相互作用介导，而第II区域则通过氢键、疏水相互作用和范德华力介导 (图2)。此外，相比于IpaH家族的其他蛋白，IpaH7.8是唯一能够特异性靶向GSDMB的成员。如果对IpaH7.8的关键氨基酸残基进行突变，会极大地影响IpaH7.8泛素化GSDMB的能力。
图2. IpaH7.8与GSDMB-N的互作界面
IpaH7.8能同时结合人和小鼠的GSDMD，却只会导致人源GSDMD的泛素化，进一步实验发现，IpaH7.8与GSDMD的相互作用受其N-端的16-21位氨基酸残基的影响。在本文的复合物结构中，这一段序列对应GSDMB的α1-β1’ 环，其中3个带负电的氨基酸残基于IpaH7.8形成广泛的相互作 (图2,b)。该序列在人类GSDMD中高度保守，但在小鼠中则存在变异。通过点突变实验，研究者发现将GSDMD中的非保守α1-β1'替换成GSDMB或人类GSDMD蛋白中相应的残基后，可以恢复IpaH7.8对小鼠GSDMD的泛素化。
在心磷脂 (cardiolipin, CL) 形成的脂质体中，颗粒酶A (granzyme A, GZMA) 对GSDMB的切割能引起脂质体内6-羧基荧光素（6-FAM）染料的迅速泄漏，表明GSDMB具备孔道形成的能力。然而，在IpaH7.8存在的情况下，6-FAM的泄漏极大地受到了抑制，其对GSDMB活性抑制的IC50为1.46±0.11μM。IpaH7.8不影响GSDMB的降解，但能直接抑制GSDMB-N与脂质体的结合。此外，IpaH7.8还能直接抑制GSDMB的抗细菌活性。以上实验数据表明，IpaH7.8可以作为GSDMB的直接抑制剂 (图3)。
图3. IpaH7.8对GSDMB孔道形成能力的影响
研究者发现，IpaH7.8介导的泛素化对GSDMB的膜结合及孔道形成有明显抑制作用，但对GSDMD的影响较小。GSDMB有31个赖氨酸，而GSDMD只有15个，GSDMB的K14和K43位点是重要的泛素化位点，其中，K14位点在α1螺旋结构末端，K43位点在膜结合处，泛素化可能因此会影响GSDMB的寡聚和膜结合能力。结合生化实验，研究者发现泛素化是GSDMB一种重要的调节途径 (图4)。
图4. GSDMB和GSDMD的泛素化位点
人体存在5种不同GSDMB 异构型，其中异构型4和异构型6具有强烈的细胞毒性，可以破坏细胞膜，异构型1不能导致细胞焦亡的发生，但可以杀死细菌。同时，研究发现，IpaH7.8 可以抑制异构型4破坏细胞膜能力。以上结果提示，GSDMB的不同异构型在linker区域的差异，可能决定了其不同的炎性效应。
为进一步探究为什么不同GSDMB异构型孔道形成的能力存在差异，研究者解析了GSDMB孔道的冷冻电镜结构。虽然GSDMB异构型1、4和6所形成的孔道的大小和形状相似，但鉴于异构型1的孔道结构在液态冰中的性质更佳，他们选择GSDMB异构型1进行了结构解析。GSDMB形成的孔道为24-26次对称，其中，24次对称的孔道内径约为150 Å，外径约为250 Å，高度约为60 Å。组成孔道的每一个GSDMB亚基都由一个球形结构域 (“手掌”) 和两个插入的β发夹结构 (“手指”) 组成。对孔道结构的进一步结构分析发现其寡聚化界面与已在GSDMA3和GSDMD中观察到的十分相似。GSDMB孔道的寡聚化是由跨膜区的β发夹结构和可溶的球形结构域共同介导，提示虽然GSDM家族成员在寡聚数量方面存在差异，却具有统一的寡聚化机制 (图5)。
图5. GSDMB孔道的冷冻电镜结构
根据GSDM家族蛋白的结构特征，研究者将其N末端α1螺旋 (binding site 1, BS1)，β1-β2环和带正电氨基酸的疏水尖端 (BS2) 以及β7-β8环 (BS3) 为脂质结合位点 (图6,c)。此外，研究者还注意到在连接GSDM两个结构域的linker中，区域1 (V229-F232) 是GSDM蛋白寡聚所必需的，而区域2 (P233-Q241) 虽然此前未被认为是孔道形成的重要结构元素，但本文却发现它可能通过一些相互作用被稳定在孔道结构中，并且该区域3个带正电氨基酸侧链可能形成另一个脂质结合位点 (BS4) 参与孔道的膜锚定。此外，在不同的GSDM亚型中这些结构元素也有一定的差异，某些亚型可能会导致细胞焦亡减弱或受到抑制。总体而言，linker区域是调节GSDM蛋白致细胞焦亡活性的关键结构要素。
图6. GSDMB中的脂质结合位点
综上，本文通过解析GSDMB–IpaH7.8复合物的冷冻电镜结构，将GSDMB N端α1-β1’环中3个带负电的氨基酸残基确定为IpaH7.8特异性识别的决定性因素，并对IpaH7.8泛素化从而抑制GSDMB的现象和机理作了进一步的阐述。此外，文章还解析了GSDMB孔道复合物的冷冻电镜结构，并探讨了其结构域间linker的差异对孔道形成能力和致焦亡能力的影响。和GSDMB孔道的冷冻电镜结构，揭示了GSDMB对细菌效应因子的识别和GSDMB致细胞焦亡发生的结构机制。实际上，在癌症的发生发展中，GSDMB也发挥着关键的作用，细胞毒性T细胞和NK细胞释放GZMA激活GSDMB从而导致肿瘤细胞焦亡是重要的抗肿瘤免疫策略之一，鉴于不同GSDMB异构型对患者生存状况存在的影响，结合本文的结构，未来对GSDMB的研究或许会对肿瘤的治疗提供新的靶点和机遇。
原文链接
参考文献
参考文献
1.Ding, J. et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family. Nature 535, 111–116 (2016).
2.Cardamone, G. et al. The characterization of GSDMB splicing and backsplicing profiles identifies novel isoforms and a circular RNA that are dysregulated in multiple sclerosis. Int. J. Mol. Sci. 18, 576 (2017).
3.Chen, X. et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26, 1007–1020 (2016).
4.CDC Yellow Book 2020: Health Information for International Travel (Oxford Univ. Press, 2019).
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
精彩回顾
精彩回顾
点击上方卡片
关注我们吧
THE END
我知道你“在看”哟