Nature | 细胞内的“建筑师”：EMC辅助离子通道组装的中间状态

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高电压激活的钙离子通道 (Ca_v1和Ca_v2) 广泛表达与肌肉、大脑和心脏等兴奋性组织，由多个亚基共同组成。在组成Ca_v的亚基中，最为关键的包括参与孔道形成的Ca_vα₁，位于胞质侧的辅助亚基Ca_vβ以及位于胞外侧的Ca_vα₂δ^1，2。

图1. 电压门控钙离子通道的亚基组成³

电压门控离子通道 (voltage-gated ion channel, VGIC) 超家族成员发挥正常功能依赖于亚基的正确组装⁴。何种伴侣蛋白参与通道的组装，通道亚基又如何正确组装是领域内长期关注的话题，然而，这些问题的答案目前仍属未知。

EMC (ER membrane protein complex) 是一个由9个蛋白亚基组成的跨膜蛋白复合物，能够辅助通道、受体或转运体插入到膜中⁵。虽然EMC的结构已在近期得到解析，但目前尚不知道EMC如何与底物蛋白结合来发挥其功能。

2023年5月17日，来自加利福尼亚大学大学的Daniel L. Minor Jr.在Nature上以加速预览的形式在线发表了一篇题为EMC chaperone-Cav structure reveal channel assembly intermediate的科研论文，报道了Ca_v1.2/Ca_vβ₃结合EMC的结构以及Ca_v1.2/Ca_vβ₃/Ca_vα₂δ-1复合物的结构，揭示了通道结构和组装对其功能的影响，对于理解VGIC以及其他膜蛋白的生物合成具有重要的意义。

本文研究者在稳定表达兔Ca_vβ₃的HEK293S GnTI-细胞中，进一步过表达了Ca_v1.2(ΔC)或Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vα₂δ-1，通过质谱对纯化得到的蛋白样品进行鉴定，发现样品中含有EMC完整的9个亚基。通过冷冻电镜数据采集和数据分析，研究者最终获得了EMC:Ca_v1.2(ΔC)/ Ca_vβ₃和Ca_v1.2(ΔC)/ Ca_vβ₃ / Ca_vα₂δ-1两种复合物的结构，整体分辨率分别为3.4Å和3.3Å。

图2. EMC:Ca_v1.2(ΔC)/ Ca_vβ₃和Ca_v1.2(ΔC)/ Ca_vβ₃ / Ca_vα₂δ-1两种复合物的整体结构

EMC与Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃形成一个分子量约为0.6 MDa的复合物，EMC与Ca_v1.2和Ca_vβ形成广泛的相互作用，包括位于EMC核心两侧相互垂直的TM dock和cyto dock。TM dock形成的互作界面较大，表面积达1051 Å2，单个EMC1的跨膜螺旋 (EMC1 transmembrane helix, EMC1 TM) 通过范德华力与Ca_v1.2第一个电压感受结构域 (voltage sensing domain I, VSD I) IS1和IS2跨膜螺旋之间的凹槽结合。Cyto dock表面积约为1500 Å2，由EMC胞质帽 (EMC2、EMC3、EMC4、EMC5和EMC8) 和Ca_vβ₃相互作用形成，其相互作用大致可以分为EMC8位点和EMC2位点2个区域。在EMC8位点内，2个Ca_vβ核苷激酶 (nucleotide kinase, NK) 结构域的loop区域与TMC8结合，7个保守的Ca_vβ残基参氢键和盐桥网络的形成。而在EMC2位点，Ca_vβ与EMC2的N端通过范德华力相互作用。

图3. EMC与Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃之间的相互作用

在Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃/Ca_vα₂δ-1的结构中，研究者在Ca_vα₂δ-1 Cache1结构域的疏水口袋中发现了1个游离的亮氨酸，该亮氨酸与周围氨基酸残基通过盐桥和氢键相互作用，其中Arg243和Asp493同时参与与亮氨酸和gabapentinoids的相互作用；除此之外，研究者还发现了一个填充在PD I和PD II之间的PE分子 (磷脂酰乙醇胺)，其亲水头部位于选择性滤过器 (selectivity filter, SF) 下方的中央孔道，与该处的2个Ca²⁺配位。

图4. Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃/Ca_vα₂δ-1中的Leucine和PE

与包裹在nanodisc中的人源EMC相比，结合Ca_v1.2/Ca_vβ₃也会显著影响EMC的构象，EMC顶部的β-propeller结构域沿膜平面侧向移动~15 Å，使EMC1的brace/crossbar螺旋向其底物方向顺移动了大约6 Å和10 Å，进而与VSD I/PD I相互作用。

EMC和Ca_vα₂δ以互斥的方式与Ca_v1.2结合，在EMC结合和完全组装状态下，Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃存在显著的构象变化。当EMC结合时，虽然VSD I和VSD II的构象相似，但存在较大的刚体位移，VSD III和VSD IV会发生不同程度的重排，其中最为显著的是VSD III的大部分会发生去折叠。此外，在结合EMC后，4个PD中的3个也会发生一定程度的变化，以PD III最为显著，在EMC结合后，PD III从中央孔道向边缘移动了5 Å左右的距离，导致PD II和PD IV发生转动，从而偏离中央孔道。此外，PD III的移动还导致了Domain III S4/S5 linker的侧向移动，从而导致VSD III去折叠的发生。

图5. Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃结合EMC后发生构象变化

在EMC的作用下，Ca_vβ₃旋转了大约5°，这种构象变化通过Ca_v1.2 AID螺旋向通道进行传递。由于AID倾斜了~15°，其C端产生~11Å的位移，使其4个AID酸性残基与5个VSD II IIS0螺旋的碱性残基相互作用，而这种相互作用在Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃/Ca_vα2δ-1中不存在。这些静电相互作用使VSD II远离通道中轴，从而解除PD III与通道中心孔道部分的连接。PD III的变化显著影响了离子传递通道的形状。由于SF和inner gate两个最窄处的变化，孔径的总体直径分别增加了约1.1Å和1.0Å，SF的扩张影响了SF谷氨酸环外离子配位位点(Glu363、Glu706、Glu1115和Glu1416)，而inner gate的扩大则会产生新的路径，在该处研究者发现了GDN的结合密度，其位置与维拉帕米在Ca_v1.1中的结合位点类似。

图6. EMC结合导致的构象变化

为进一步探究单独的通道亚基能否与EMC结合，研究者表达了Ca_v1.2(ΔC)或Ca_vβ₃，结合质谱鉴定，发现只有前者可以结合EMC，但定量分析显示其中的EMC含量少于EMC:Ca_v1.2(ΔC)/Ca_vβ₃复合物中的EMC含量，提示Ca_v1.2的α亚基本身可以结合EMC，且这种作用可以被Ca_vβ的结合进一步增强。

此外，为了探究EMC的作用，研究者设计了不同Ca_v1.2和Ca_vβ₃突变体，利用全细胞膜片钳，发现EMC与通道结合位点的突变会通过减少通道在细胞膜上的表达而影响其功能的发挥。此外，Ca_vβ₃的突变也会影响通道与EMC的结合，提示Ca_vβ在cyto dock位点与EMC的相互作用在EMC:Ca_v复合物形成以及通道的正常表达和功能发挥中起到了重要的作用。

图7. 突变位点

综上，本文的结构揭示了EMC与其底物蛋白之间的相互作用，确定了这种相互作用对通道功能的影响，此外，研究还揭示了EMC与Ca_vα₂δ与Ca_v1.2结合的互斥性。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06175-5

参考文献

参考文献

1．Buraei, Z. & Yang, J. The {beta} Subunit of Voltage-Gated Ca2+ Channels. Physiol Rev 90, 1461-1506 (2010).

2．Dooley, D. J., Taylor, C. P., Donevan, S. & Feltner, D. Ca(2+) channel alpha(2)delta ligands: novel modulators of neurotransmission. Trends Pharmacol Sci 28, 75-82 (2007).

3．Jacob, Nilan. Drug targets: ligand and voltage gated ion channels. International Journal of Basic & Clinical Pharmacology. 6, 235 (2017)

4．Isacoff, E. Y., Jan, L. Y. & Minor, D. L., Jr. Conduits of life's spark: a perspective on ion channel research since the birth of neuron. Neuron 80, 658-674 (2013).

5．Satoh, T., Ohba, A., Liu, Z., Inagaki, T. & Satoh, A. K. dPob/EMC is essential for biosynthesis of rhodopsin and other multi-pass membrane proteins in Drosophila photoreceptors. Elife 4 (2015).

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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THE END

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