Science | 布氏锥虫RNA编辑的奥秘

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在撒哈拉以南的贫困地区，动鞭毛虫感染所导致的疾病是十分值得关注的公共卫生问题，其中尤为引人注意的，是布氏锥虫 (Trypanosoma brucei) 所导致的锥虫病¹。布氏锥虫经由舌蝇传播，患者感染晚期会出现神经系统症状，出现嗜睡和昏迷的情况，严重时甚至会导致患者死亡，因而布氏锥虫感染所导致的疾病又称为嗜睡性脑炎或非洲睡眠病。

目前针对布氏锥虫感染的治疗方案复杂，且具有较大的毒性，因此，临床上亟需寻找新的治疗靶点以开发更为安全有效的药物。在所有的候选靶点中，锥虫的编辑体 (editosome) 吸引了研究者的注意。锥虫的RNA编辑能在转录后水平通过大规模插入和删除尿嘧啶，以恢复线粒体中隐蔽基因的蛋白编码能力，这一过程主要通过gRNA (guide RNA) 介导²。布氏锥的编辑体由RNA编辑底物结合复合物 (RNA-editing substrate-binding complex, RESC) 和RNA编辑催化复合物组成 (RNA-editing catalytic complex)³，能够对gRNA介导的编辑进行调节，将线粒体中的转录本重新编码为mRNA¹。由于复合物高分辨率的结构信息的缺乏，信息从gRNA向mRNA传递的机制目前还不清楚，针对这一过程的药物研发也受到一定程度的限制。

图1. RESC复合物结构

2023年7月7日，来自加利福尼亚大学的周正洪和波士顿大学医学院的Ruslan Aphasizhev共同通讯，在Science上在线发表了题为Structural basis of gRNA stabilization and mRNA recognition in trypanosomal RNA editing的科研论文。该工作通过结合生物化学、质谱、RNA分析和cryoID方法，利用单颗粒冷冻电子显微捕获了RESC的三种状态，揭示了促进gRNA-mRNA杂交的重塑事件以及编辑体大分子底物组装的机制。

为了分离得到能够结合gRNA的RESC复合物，研究者分别对RESC的组成亚基RESC2、RESC5、RESC9和RESC14进行纯化，发现纯化RESC2得到的蛋白样品中含有大量的RESC1/2和KREH2解旋酶，纯化RESC9和RESC14得到的蛋白样品中缺乏RESC1-4以及RESC15-18，相比之下，纯化RESC5得到的蛋白样品中RESC组分相对均一，且含有较高比例的RECC (图2)。因此，研究人员选择利用RESC5进行后续冷冻样品的制备，此外，为了减少样品的异质性，在纯化前，研究者用RNase对样品进行了处理。

图2. RESC5纯化结果

通过冷冻电镜数据采集和分析，研究人员获得了3种不同的RESC复合物结构，并将它们分别命名为RESC-A、RESC-B和RESC-C (图3)。其中，RESC-A (~380 kDa)包含RESC1-6 (包括稳定gRNA的RESC-1/2二聚体)，RESC-B (~600 kDa) 包含RESC5-11、RESC13和RESC14，RESC-C (~270 kDa) 由RESC5-8以及RESC10-14共同组成。绝大多数的RESC组分由α螺线管 (HEAT repeats) 结构组成。

图3. 3种RESC复合物的整体结构

RESC-A为一个六亚基复合物，其中，RESC1和RESC2之间具有31％的序列相似性，以异源二聚体的形式存在。RESC2 TTM (triphosphate tunnel metalloenzyme) 结构域中突出的发夹环沿着RESC1 TTM结构域外的裂隙，形成大量的疏水相互作用和氢键，RESC2的ARM (armadillo) 结构域和RESC1 TTM结构域之间的氢键进一步增强了它们的相互作用。RESC1/2异源二聚体通过RESC2 ARM结构域的延长环占据RESC6 HEAT的超螺旋内表面，并形成氢键，RESC5则通过氢键和疏水相互作用与RESC6相互作用，在RESC5和RESC6之间形成一个带正电的缝隙，可能有利于RNA结合 (图4)。

图4. RESC-A结构

在未经RNase处理的样品中，研究者还解析得到了RESC-A结合gRNA的3.7 Å的结构。结合与未结合gRNA的RESC-A复合物整体结构相似，二者主要差别在于，在gRNA结合的位置附近，RESC1和RESC2中原本无序的loop变得有序 (图5)。gRNA的5’磷酸被RESC2的三磷酸结合通道包裹，3’端则位于RESC5和RESC6所形成的缝隙内，“anchor”和“guiding”区域形成~18 bp的发夹结构，提示gRNA需要经历巨大的构象变化才能够识别mRNA，发夹结构的形成和RESC5/6对3'末端的保护使得gRNA不易受到3'→5'降解的影响。以上结构信息提示，或许RESC1/2异源二聚体尚不足以发挥稳定gRNA的作用，RESC-A的形成才是gRNA稳定的关键。

图5. RESC-A结合与不结合gRNA的结构

RNase处理过与未处理过的样品中，RESC-B复合物整体结构相似 (在未处理的样品中，RESC-B含额外的RNA密度) (图6)。RESC7-12亚基中存在多个helix-loop-helix的结构基序，其中RESC8-12形成延伸的超螺旋HEAT结构域。RESC-B中存在2条RNA密度，其中，较短的片段与RESC5、RESC6和RESC10接触，16位到12位的核苷酸堆叠在RESC5与RESC6之间，类似于RESC-A复合物中gRNA的结合方式，因而此处的RNA密度被暂时认为是gRNA的密度。在RESC-A复合物中，gRNA形成发夹结构，而在RESC-B复合物中则以单链形式存在。gRNA与RESC5/6的持续结合能够确保正确3'加工的分子进入编辑级联反应。

通过对RNA密度进行模型搭建，结合在体RNA-蛋白交联数据，研究者认为复合物中较长的核苷酸片段即为mRNA片段，该片段跨越整个RESC-B复合物，与所有蛋白亚基之间均存在相互作用。mRNA的3’区域与gRNA的5’端处于接近的位置，从而使得gRNA与mRNA能够在RESC-B表面杂交。

图6. RESC-B的结构

在上述的结构中可以发现，复合物中许多RESC组分均可以和RNA发生相互作用。为了进一步确定各个RESC组分结合的RNA，研究者对活体寄生虫进行了UV交联，并对RNA-蛋白质交联产物进行纯化和测定。结果发现，RESC1和RESC2对gRNA的结合具有明显的偏好，而RESC7-14主要与mRNA结合，RESC5、RESC6与RESC10则结合gRNA-mRNA。

在典型的gRNA中，“guiding”区域与U尾之间存在一些无法与mRNA配对的核苷酸。在本文的结构中，RESC5/6/10将含较少信息的gRNA 3'端隔离，使得“guiding”区域和“anchor”区域可以与RESC-B表面之外的mRNA杂交，因此能够与RECC相互作用。结合结构和过去的研究结果，本文研究者认为RESC-B可能是RECC的催化底物，在gRNA完成定位事件后，RESC-B可能会暴露gRNA和mRNA形成的双链以进行后续反应 (图7)。

图7. RESC-B中gRNA-mRNA的杂交机制

综上，本文解析了RESC复合物3中不同状态的结构，这些关键结构信息可能有助于开发新的抗锥虫药物。

原文链接

https://www.science.org/doi/10.1126

/science.adg4725

参考文献

参考文献

1. R. Benne et al., Major transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell 46, 819–826 (1986).

2. D. A. Maslov, L. Simpson, The polarity of editing within a multiple gRNA-mediated domain is due to formation of anchors for upstream gRNAs by downstream editing. Cell 70, 459–467 (1992).

3. I. Aphasizheva et al., RNA binding and core complexes constitute the U-insertion/deletion editosome. Mol. Cell. Biol. 34, 4329–4342 (2014).

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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