Science | 一个噬菌体的使命：揭示噬菌体ΦX174编码蛋白抗菌机制

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大肠杆菌菌液越摇越清？看着面前澄清的摇瓶，想必很多人会怀疑是噬菌体（phage）在“暗中作梗”，养菌人与噬菌体自此势不两立。事实上，作为生命周期的一部分，病毒必须从宿主逃离。对噬菌体而言，这一过程需要攻破细菌的细胞壁和肽聚糖，从而导致细胞溶解。从另一个角度看，这使得噬菌体在抗菌治疗方面体现了一定的价值。大约一百年前，人们采用鸡尾酒疗法治疗细菌感染，其中含有重要的噬菌体ΦX174，是噬菌体的首次医疗应用¹。不过，要想通过噬菌体治疗解决细菌的耐药性问题，就需要对噬菌体杀死宿主的机制有基础的认知。

ΦX174是微小噬菌体科（Microviridae）亚家族Bullavirinae中的成员，它以大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）为首要宿主，因此广泛存在于含有大肠杆菌的环境中，如人的肠道²。其基因组中具有11个开放阅读框（open reading frames，ORFs）³，其中负责溶菌（lysis）的基因E存在于脚手架基因D的ORF中⁴，只表达E便足以杀掉细菌⁵。关于噬菌体的溶菌机制有多种说法，其中最为可能的是E蛋白会破坏肽聚糖（peptidoglycan，PG）的生物合成，导致细胞壁出现裂缝。尤其是之前的研究证明E蛋白可以直接抑制依赖于细胞质伴侣SlyD（sensitivity to lysis D）的整合膜蛋白酶MraY^6-8，而MraY能够催化可溶核苷糖肽和磷脂底物合成肽聚糖前体。

近期，美国加州理工学院的William M. Clemons Jr带领其团队通过冷冻电镜技术揭示了E蛋白可以作为桥梁连接两个细菌蛋白MraY与SlyD，并形成跨膜复合物YES，通过减少脂质I的生成抑制肽聚糖的生物合成，为理解噬菌体介导的溶菌机制提供了基础，其研究成果“The mechanism of the phage-encoded protein antibiotic from ΦX174” 于2023年7月14日发表在Science期刊上。

E蛋白由91个氨基酸组成，具有保守的N端跨膜区（transmembrane domain，TMD），其C端胞质区具有一个预测的两亲性螺旋和一个松散的尾部，螺旋中具有保守的正电氨基酸（图 1A）。在之前的研究中，将球状蛋白融合到TMD的C端发现，TMD足以实现溶菌效果，突变分析鉴定了其关键氨基酸包括第21位脯氨酸P21。然而，SlyD与MraY如何与E蛋白一起使细胞壁破裂，仍然未知。

MraY是抗菌药物的一个重要靶点，能够催化磷酸-乙酰胞壁酸-五肽（phospho-MurNAc-pentapeptide）从帕克核苷酸（Park’s nucleotide）（二磷酸尿苷-乙酰胞壁酸-五肽，UDP-MurNAc-pentapeptide）转移到产生脂质I的55碳聚异戊二烯基磷酸（C₅₅P）的磷酸基团上。MraY在去垢剂中的晶体结构表明，其具有保守的同源二聚体结构，每个亚基有十个TMDs。这些结构将活性位点定位在TMDs 4、5和9形成的一个膜暴露裂缝的胞质侧前庭处，是脂质底物的预测进入位点。金属伴侣蛋白SlyD具有两个保守的核心结构域：FK506结合蛋白（FKBP）脯氨酰异构酶结构域和通过β增强（β-augmentation）结合未折叠肽的插入瓣（insertion-in-flap，IF）结构域。SlyD无序的C端对金属的结合很重要，但删除不影响其伴侣蛋白活性。

这篇研究中，研究者们解析了二聚的异源三聚体YES复合物结构（大肠杆菌EcMraY，病毒E蛋白和大肠杆菌EcSlyD）。E蛋白序列来自Bullavirinae亚家族的噬菌体ΦX174或ID21，ID21所得的E蛋白相对更短，为76个氨基酸。在WT E.coli菌株中分别表达两种E蛋白时，其溶菌效率相似（图 1C）。通过共表达带有亲和标签的E_ΦX174和野生型（wild type，WT）EcMraY，研究者们得到了含有内源EcSlyD的稳定复合物，但SlyD条带不单一。若将SlyD的C端无序区截去，其仍能够恢复E. coli ΔslyD菌株的溶菌活性，且共表达三个蛋白所得的YES复合物经过去垢剂提取和纯化，SEC可以得到单一的峰且SDS-PAGE胶具有单一的SlyD条带（图 1B），故后续实验采用了截短体SlyD₁₅₄。

图 1 YES复合物结构

通过冷冻电镜技术，YES_ID21和YES_ΦX174复合物的结构均得到了解析，整体分辨率分别为3.5 Å和3.6 Å，图 1D所示为 YES_ID21复合物结构。当移去去垢剂微团（detergent micelle）时，可以清晰地看到22个TMDs，其中20个来自EcMraY二聚体，在MraY二聚体的膜暴露表面周围可以看到一些脂质密度（图 1D, E）。胞质的密度来自两个SlyD分子，是复合物中最柔性的区域。E蛋白的N端从外周质开始，其TMD结合在MraY TM5和TM9形成的凹槽中，最终停留在胞质侧，并急转弯伸向活性口袋（图 1E和2A）。TMD紧接着是一个穿过活性位点的两亲性螺旋，其与膜平行，带正电的一面对着MraY，疏水面对着SlyD的IF结构域。两个E蛋白分子的C端从不同的氨基酸处穿过对方，SlyDs的方向也稍有不同，使得二聚复合物的对称性在胞质处被打破。

图 2 E蛋白与EcMraY的相互作用

之前的功能研究一致认为第21位脯氨酸是必需的，该研究所解析的结构则对这一需求作出了漂亮的解释。如图2 A所示， E蛋白的TMD结合在MraY具有角度的TM9b所界定的凹槽中，第21位的脯氨酸打破了氢键并形成了一个纽结，使得TM9b周围的TMD在凹槽之后弯曲到活性位点。P21的突变会使纽结消失，形成的竖直TMD无法结合在凹槽处。此外，氨基酸P29同样保守，其形成的第二个弯曲完成了对TM9b的包裹，此位点突变会使溶菌延迟。TMD中额外的丙氨酸突变也确定了一些导致溶菌延迟的氨基酸，它们被假定是降低了E蛋白和MraY的结合亲和力。从结构上看，这些氨基酸中的大多数（L19, L20, L23, 和M26）与MraY有直接的接触（图 2C）。胞质处，E蛋白的氨基酸A36至M50形成的两亲性螺旋横跨MraY亚基，其亲水面伸向MraY活性位点的膜侧。这一螺旋含有保守的带正电氨基酸，与MraY中保守的带负电氨基酸相互作用（图 2D）。其中一个例子是K46形成的盐桥，K46A突变会导致溶菌延迟开始（图 2E）。螺旋终止于两个E蛋白的交叉处，分别为EA的V54和EB的A51，使其与MraY具有不同的相互作用。此外，L19与L23均位于MraY保守的F182附近，可能通过芳香族的π相互作用增加了稳定性（图 2C）。

E蛋白的表达会引起溶菌的发生，导致一些被杀死的细菌成为“幽灵”——只剩下空荡的细胞壁，这种幽灵曾被用于疫苗的开发。为了制造出这种没有“肉体”的幽魂，E蛋白必须抑制靶标细菌的MraY。尽管ΦX174钟情于E.coli，E蛋白的表达也可以成功使被测的其它革兰氏阴性菌成为幽灵，但无法使革兰氏阳性菌溶菌。有一些氨基酸可能在其中起到了重要作用，如EcMraY的P170，其突变为亮氨酸会对溶菌产生抗性，且此氨基酸在革兰氏阳性菌中缺失。EcMraY的Y134在该研究的模型中与E蛋白M26形成了桥梁（图 2C），同样在革兰氏阳性菌中缺失。

图 3 E蛋白抑制机制

根据YES复合物的结构，研究者们提出了一个E蛋白抑制MraY的简单机制。如图3所示，将先前的MraY复合物结构与YES复合物结构叠加发现，C₅₅P的聚异戊二烯链预测走向为TM5与TM9形成的凹槽，会被E蛋白占据。因此，一个抑制机制便是E蛋白阻止了脂质底物进入活化位点（图 3A）。E蛋白是帕克核苷酸的非竞争性抑制剂，在结构中，其核苷酸结合口袋是完全可以接近的（图 3B）。MraY的环9-10含有催化组氨酸，需要沿着结合口袋移动形成活性位点，从而实现催化功能。E蛋白的胞质侧螺旋将环9-10与活性位点的其余部分分离，阻断了这种转变，提供了第二个抑制机制。总而言之，E蛋白阻挡了脂质底物的进入并阻止了底物结合活性位点的形成。

尽管之前已有MraY的晶体结构，但该研究的YES复合物结构揭示了E.coli MraY具有不同的结构。MraY单体与之前结构的骨架均方根偏差（RMSDs）约为1 Å（图 4A），研究者们对之前的无序区进行了建模，包括包围活性位点的胞质环。环1-2似乎在催化循环中采取了不同的构象，它们在二聚体中的构象有细微的不同。环9-10采用了与之前报道的MraY小分子抑制剂共结晶结构相似的构象，但与载脂蛋白的结构不同（图 4）。环9-10的这种构象可能是MraY与抑制剂形成复合物的普遍特征。

在之前的晶体结构中，MraY的N端开始于TM1或者是以与膜双分子层不同的方向从结构伸出的一个螺旋（图 4B）。在YES复合物中，第一个螺旋的N端（N-terminal end of the first helix，NTH）与TM2的C端以氢键相连，有效地形成了一个螺旋堆叠结构（图 4B）。在不同细菌之间进行多序列比对发现，MraY的NTH在革兰氏阴性菌中保守，但在革兰氏阳性菌中缺失。

图 4 E.coli MraY冷冻电镜结构中观察到的特征

在YES复合物的结构中，可以MraY的膜界面看到脂质密度（图 1D）。之前的研究认为阴离子磷脂对MraY有重要作用，例如稳定二聚体。在二聚体的界面也确实能看到大量的脂质密度（图 5），其特征与甘油磷脂一致，尽管不是所有密度都能够被清楚地分配。正如之前的结构，MraY二聚体的疏水性周质腔含有未解释的密度（图 4C），尽管这一密度具有清晰的结构，研究者们还是无法将其与E.coli的磷脂进行匹配。近期，其他研究利用原生质谱和分子动力学鉴定了二聚体界面具有C₅₅P的结合位点，其磷酸头被预测与EcMraY的R341形成盐桥。在该研究解析的结构中，确实可以在二聚体界面看到一个长条形密度，其结束于R341，与C₅₅P一致。尽管研究者们无法确定这一脂质，但其密度与C₅₅P一致，尽管这一结合位点仍待验证。

图 5 结合在YES复合物中可能的脂质密度

E蛋白的两亲性螺旋所连接的两个E.coli蛋白MraY与SlyD彼此之间没有特别的接触（图 2A）。SlyD的IF结构域位于E蛋白螺旋的疏水面（图 6A）并接触另一个E蛋白伸出的C端，且E蛋白C端继续延伸并结合FKBP结构域（图 6B），SlyD与E蛋白C端具有高亲和力相互作用。这使得SlyD结合两个E蛋白的可溶区，形成蝴蝶结状相互作用（图 1E）。这些E蛋白界面证实了SlyD的结构研究，即肽段与这里所见的每一个界面结合，包括IF结构域凹槽中的β-augmentation（图 6C, D）。

图 6 E蛋白与SlyD的相互作用

E蛋白在SlyD缺失时不稳定，很快会被降解。E_ΦX174在缺失SlyD时无法促使溶菌的发生，但溶菌在表达EcSlyD或EcSlyD₁₅₄时可以被补救。嗜热细菌Thermus thermophilus（Tt）SlyD与EcSlyD结构高度同源（图 6D），在ΔslyD菌株中也可以补救溶菌作用。当引入降低SlyD脯氨酰异构酶活性的突变时，同样可以补救溶菌作用。若用这种能够补救的突变体纯化E蛋白复合物，则会发现复合物很不稳定且在SEC中具有聚集的峰。这些结果说明SlyD的脯氨酰异构化在溶菌作用中并没有首要作用，但在保护E蛋白和稳定YES复合物中非常重要。

综上所示，ΦX174抑制肽聚糖生物合成的机制非常简单。E蛋白通过结合在活性位点，阻止脂质底物的进入并阻挡催化所需的构象变化。YES复合物的结构为先前ΦX174溶菌结果的解释提供了模板。这些结果也为未来单基因溶菌蛋白在治疗上的应用提供了思路，基于结构信息优化ΦX174 E蛋白的效率或许可以帮助这些疗法在对抗耐药病原体时发挥极大的潜力。

原文链接

https://www.science.org/doi/10.

1126/science.adg9091#f5

参考文献

参考文献

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供稿 | 张颖

审稿 | 田露

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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