Nature｜不同以往：TDP-43在A型FTLD-TDP中形成了V型折叠的淀粉样细丝

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2014年，一项名为“ALS冰桶挑战”的活动开始风靡全球，比尔·盖茨等知名人士也曾参与，使越来越多的人了解肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），即“渐冻症”。几乎所有的ALS病例和大约一半的额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration，FTLD）病例中，均可以观察到神经元和神经胶质细胞TAR DNA结合蛋白43（TAR DNA-binding protein 43，TDP-43）异常组装的特征^1,2。之前的研究从ALS和B型FTLD患者的前额叶和运动皮层得到了组装的TDP-43，通过冷冻电镜解析结构发现，该来源的TDP-43均形成了双螺旋状折叠的淀粉样细丝³。然而，在没有ALS疾病的FTLD患者中，TDP-43的结构仍然未知。

2023年8月2日，来自英国剑桥MRC分子生物学实验室的Benjamin Ryskeldi-Falcon带领其团队在Nature期刊上发表了其研究成果，题为“TDP-43 forms amyloid filaments with a distinct fold in type A FTLD-TDP”。该研究利用冷冻电镜解析了具有TDP病理特征的A型FTLD患者（frontotemporal lobar degeneration with TDP-43 pathology，FTLD-TDP）大脑的TDP-43结构。结果表明，TDP-43形成了淀粉样细丝，且在不同的神经退行性疾病中具有不同的折叠方式。

TDP-43是一个广泛表达的RNA结合蛋白，在RNA加工过程中具有多种作用，其主要存在于核糖核蛋白颗粒，但也会经历核质-胞质穿梭，以参与胞质中的核糖核蛋白颗粒。TDP-43的N端包含一个DIX (dishevelled and axin) 结构域、核定位信号和串联RNA识别模体（RNA-recognition motifs，RRMs），其C端含有一个无序的低复杂度结构域（low-complexity domain，LCD），该结构域富含甘氨酸、疏水氨基酸、谷氨酰胺和天冬酰胺（glutamine and asparagine，Q/N）。DIX结构域、RRMs和LCD均有助于TDP-43与核糖核蛋白颗粒以及RNA结合。疾病状态下，全长TDP-43与异常截短的C端片段（C-terminal fragments，CTFs）组装，并被泛素化和磷酸化。组装物具有颗粒丝状形态，直径在10-15 nm，与淀粉样亲和染料硫磺素S（thioflavin-S）结合较差。

在该研究中，研究者们从A型FTLD-TDP患者前额叶皮层分离得到了TDP-43组装物，这些组装物具有全长TDP-43和CTFs，且在S409和S410位点处发生了磷酸化。通过冷冻电镜成像，研究者们在GRN突变和具有野生型GRN的患者前额叶皮层提取物中发现了一些直的、无分支的细丝，这些细丝具有颗粒状表面，宽度在10-15 nm，与之前报道的FTLD-TDP患者大脑原位TDP-43细丝一致。随后，研究者们对TDP-43细丝的有序核心进行了结构解析，分辨率达2.4 Å（图 1a）。这些细丝由TDP-43分子堆叠形成的淀粉样原丝组成，且不同患者的TDP-43细丝折叠方式一致，与GRN的基因突变无关，这些结果意味着TDP-43淀粉样细丝的折叠可能是A型FTLD-TDP的特征。

在该研究揭示TDP-43在脑中形成淀粉样细丝之前，有研究表明在未患ALS的A-D四种类型FTLD-TDP患者中未发现TDP-43的淀粉样细丝，但有跨膜蛋白106B（transmembrane protein 106B，TMEM106B）形成的细丝⁴。也有其他文献报道在许多神经退行性疾病中，TMEM106B细丝随着年龄的增长在人脑中不断累积^5-7。在这篇研究中，研究者们也发现了TMEM106B单丝和双丝，宽度分别为12 nm和16 nm，表面无颗粒状。TMEM106B细丝在tau蛋白病（tauopathies）和α-突触核蛋白病（α-synucleinopathies）患者的脑中，以及神经系统正常的个体中均存在，且TMEM106B与TDP-43、tau和α-synuclein不共定位。不同的TMEM106B细丝折叠与疾病之间没有明确的关联。

图1 A型FTLD-TDP患者TDP-43淀粉样细丝的冷冻电镜结构

如图 1b-d所示，研究者们搭建了TDP-43细丝折叠的原子模型。其折叠部分由LCD的R272-Q360形成的五个相连的层组成，前两层由甘氨酸富集区（G274-G310）形成，疏水区（M311-S342）促成了第三和第四层，Q/N富集区（Q343-Q360）形成了第五层。这种折叠以第四层的A321-Q331形成的纽结状的11个氨基酸β折叠为中心，这个β折叠与相邻第三层和第五层的β折叠形成立体的拉链，并形成了一个类似于三条纹V型的排列标志。层与层之间通过大量中性极性氨基酸和甘氨酸形成的氢键相连。低序蛋白密度从N端氨基酸R272开始延伸，覆盖由W334-A341形成的疏水块，依次连接第四和第五层（图 1c,d）。这一密度可以容纳大约17个氨基酸（V255-E271），包括第二个TDP-43 RRM的β5。因此，N端至V255以及C端至Q360形成了细丝的模糊外壳。细丝部分或完全缺失V255-E271的CTFs或许解释了这一额外的蛋白密度为何更加无序。其存在会使得疏水块（W334-A341）暴露，淀粉样细丝的疏水表面被认为参与了异常的互作。

另一个类似多肽的密度位于第五层的表面，与G351-N355相邻（图 1a,d）。其可能来自N端或者C端的侧面区域，或者来自一个互作的蛋白，其不连续的性质阻碍了序列的排布。之前的研究表明，不连续的肽段与α-synuclein细丝有关。此外，研究者们在第一、第二和第三层之间的腔内也发现了非蛋白密度（图 1d）。该密度似乎沿着螺旋轴部分相连，可能因为它们不遵循与TDP-43相同的螺旋对称性。被包埋的非蛋白密度在人脑来源的tau和α-synuclein细丝中也曾被发现，它们可能会作为细丝形成的辅因子。

具有最大数据量的患者冷冻电镜细丝片段3D分类结果显示，N端R272-G295区域以及连接第四和第五层的G335-Q343具有替代构象（图 2a-c）。不到5%的细丝片段分类得到了这些替代构象，说明它们比较少见。

 图2 A型FTLD-TDP的TDP-43淀粉样细丝局部替代构象

随后，研究者们解析了具有替代构象的细丝片段的结构，分辨率为2.5 Å（图 2a）。在N端的替代构象中，G281-G295几乎沿着主要构象R272-P280的相同路径，R293暴露在细丝表面，且氨基酸R272-P280在模糊外壳中（图 2b）。在连接第四和第五层的替代构象中，一些氨基酸改变了它们的内外侧位置，M336、A341和Q343变为埋在内侧，而M339和S342暴露在表面（图 2c）。同一个患者的细丝中，具有不同局部构象的TDP-43可以共同存在（图 2d）。

在V型折叠的主要构象中，R293的侧链完全被包裹，其正电荷只通过与周围肽段形成氢键部分抵消（图 3a）。对于这一包裹的氨基酸，研究者们提出了假设，即翻译后修饰的瓜氨酸化（脱氨基）可能促进了该氨基酸的包埋，这一修饰使得精氨酸的带电胍基被水解，产生中性的脲基（图 3b）。质谱鉴定证实了TDP-43的R293被瓜氨酸化，意味着瓜氨酸化可能通过去掉R293的电荷促进A型FTLD-TDP中TDP-43细丝的形成。

 图3 A型FTLD-TDP的TDP-43淀粉样细丝R293翻译后修饰

此外，质谱结果发现一些TDP-43分子的R293发生了单甲基化，其单甲基化在生理条件下也曾被观察到。由于空间位阻，甲基化的R293与细丝的主要折叠构象并不适配，其只能适应N端的替代构象，即侧链暴露（图 3c）。由于这种替代构象很少见，R293只能在一小部分TDP-43分子中被甲基化。总而言之，该研究的结果表明R293的翻译后修饰可能会改变其带电和侧链大小，从而影响A型FTLD-TDP的TDP-43细丝局部结构变化。

不同于患有ALS和B型FTLD-TDP个体的双螺旋状折叠，A型FTLD-TDP的TDP-43细丝形成了V型折叠，意味着不同的TDP-43淀粉样细丝是不同类型神经退行性疾病的特征（图 4）。这使得人们开始关注特定蛋白在神经退行性疾病中的不同淀粉样细丝折叠方式。在A型FTLD-TDP中形成V型折叠的与在ALS和B型FTLD-TDP中形成双螺旋的，是TDP-43 LCD的同一部分，但V型的N端多出来了10个氨基酸（R272-G281）。这些多出的氨基酸可能解释了为何A型FTLD-TDP相比于ALS和B型FTLD-TDP具有不同的CTFs。

图4 A型FTLD-TDP与ALS和B型FTLD-TDP的TDP-43淀粉样细丝折叠对比

疏水区的氨基酸A321-Q331在两种细丝折叠中保守，两种细丝折叠的差异主要是疏水区结构排布的不同。双螺旋折叠中，这一区域形成了紧凑的疏水簇。而在V型折叠中，由于更广泛的β结构，其采取了伸展的构象，并由富含甘氨酸和Q/N区域的β折叠形成拉链稳定构象。Q/N富集区域在两种折叠中具有相似的二级结构，但其侧链的内外侧走向相反。

两种细丝折叠的不同可能解释了两种疾病来源的TDP-43组装物在细胞和动物模型中的不同可种性毒性，这可能为不同类型的FTLD-TDP造成了不同的病理基础。不同类型的FTLD-TDP由脑中TDP-43组装物的分布区分，意味着局部环境可能会影响TDP-43细丝的折叠。在模型系统中减少疾病相关细丝折叠的形成将成为验证这些假设的关键。迄今为止，体外组装TDP-43细丝还未重现其大脑来源的结构。

总而言之，该研究证实了TDP-43在A型FTLD-TDP中同样形成了淀粉样细丝。其V型折叠不同于ALS和B型FTLD-TDP中的双螺旋折叠，意味着不同的TDP-43淀粉样细丝折叠是不同类型神经退行性疾病的特征。其结构表明了精氨酸的翻译后修饰在细丝形成以及同一个体来源的细丝结构变化中的作用。这项工作将为TDP-43组装的机制研究提供指导，并推动靶向TDP-43组装物的诊断和治疗的发展。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06405-w

参考文献

参考文献

1. Neumann, M. et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science 314, 130–133 (2006).

2. Arai, T. et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 351, 602–611 (2006).

3. Arseni, D. et al. Structure of pathological TDP-43 filaments from ALS with FTLD. Nature 601, 139–143 (2022).

4. Jiang, Y. X. et al. Amyloid fibrils in FTLD-TDP are composed of TMEM106B and not TDP-43. Nature 605, 304–309 (2022).

5. Schweighauser, M. et al. Age-dependent formation of TMEM106B amyloid filaments in human brains. Nature 605, 310–314 (2022).

6. Chang, A. et al. Homotypic fibrillization of TMEM106B across diverse neurodegenerative diseases. Cell 185, 1346–1355.e15 (2022).

7. Fan, Y. et al. Generic amyloid fibrillation of TMEM106B in patient with Parkinson’s disease dementia and normal elders. Cell Res. 32, 585–588 (2022).

供稿 | 张颖

审稿 | 田露

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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