Nature | 钾离子通道如何失活？
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电压激活钾离子 (voltage-activated potassium, Kv) 通道在电信号转导、神经递质和激素分泌以及离子稳态等生理过程中发挥重要作用1。作为人类基因组中最大的离子通道家族，目前已有12个亚家族中的40个成员被鉴定1。
图1. 钾离子通道与电压激活钾离子通道2
Kv2.1广泛表达于皮层和海马中的锥体神经元，对动作电位形状、发放频率等有重要的调节作用3。此外，Kv2.1还在胰岛的β细胞中表达，对胰岛素的分泌进行调节4。Kv2.1的显性突变会导致患者发生癫痫性脑病5，Kv2.1敲除的小鼠也会出现癫痫、多动和空间学习缺陷等病理表现6。虽然Kv2.1具有重要的病理生理意义，其结构至今仍未得到解析。
延迟整流和缓慢失活是哺乳动物Kv2.1的两个主要特征，作为哺乳动物神经元中一个重要的延迟整流钾离子通道7。Kv2.1的缓慢失活既可以在开放状态发生，也可以在关闭状态发生，其从失活状态的恢复有很强的电压依赖性，然而，该过程的分子机制仍不清楚。
2023年9月27日，来自美国NIH的Kenton J. Swartz在Nature上在线发表了一篇题为Inactivation of the Kv2.1 channel through electromechanical coupling的论文。文章报道了Kv2.1在类膜环境中的结构，同时对致人类癫痫性脑病的一系列突变进行了进一步的探究。
本文结构解析所用的Kv2.1来源于大鼠，为功能与全长蛋白类似的C端截短体。通过将蛋白重构到nanodisc中，并用冷冻电镜进行数据采集，研究者解析得到了Kv2.1跨膜 (transmembrane, TM) 结构域的结构，由于N端和C端局部分辨率受限，研究者并未对这些区域进行建模。本文得到的Kv2.1 TM区整体分辨率为2.95 Å，与先前解析的其他Kv2.1通道结构类似：四聚体Kv2.1通道的每个亚基均由跨膜螺旋S1-S6组成，每个亚基的S1-S4形成电压感受结构域 (voltage-sensing domain, VSD)，S5-S6排列形成中央的孔道结构域 (pore domain,PD)。与Kv1通道结构相似，Kv2.1 S1-S4位于相邻亚基的S5-S6附近。此外，本文结构中还能观察到与蛋白结合的多个磷脂分子的密度 (图2)。结合结构分析和电生理实验，研究者认为Kv2.1的VSD处在激活状态。
图2. Kv2.1整体结构
此外，在离子选择性过滤器 (selectivity filter, SF) 所在的外侧孔道中，研究者还观察到了位于中央轴线上的4处强电子密度，提示SF被离子占据。在使用HOLE对孔道直径进行测量时，发现其外侧孔道的直径与其他Kv通道不同，而内侧的扩张程度与处于开放状态的Kv1通道类似 (图3)。
图3. Kv2.1的中央孔道
临床上，Kv2.1编码基因的错义突变会导致癫痫性脑病的发生，过去的研究发现，在位于Kv2.1 PD的4个与癫痫性脑病相关的突变中，有3个突变会导致通道功能丧失，而另一个会使通道失去对K+的选择性。结合本文解析的结构，研究者对引起癫痫性脑病的15个突变进行了进一步的分析，发现位于PD (S343R、T370I、G375R、G377R、P381T) 或S6 (C393F、G397R) 上的突变会导致通道功能的丧失，而另外7个突变也会在不同程度上导致通道功能增强或减弱。F412L是15个突变中最为特殊的存在，无论外液K+浓度如何变化，在实验所使用的各种电压条件下，该突变体都无法导电，然而，带电的S4在跨过膜电势时所产生的强大的门控电流却可以在该突变体中被检测到 (包括ON门控电流和OFF门控电流) (图4)。
图4. F412突变所在位置及其电生理特性
在结构中，F412位于S6的内端，指向S1-S4 VSD，与同一亚基S4-S5 linker上的S316，以及相邻亚基S5和S6上的L329、L403等疏水氨基酸残基形成相互作用。过去针对Kv1通道的结构和功能研究认为，由于S4的运动可以驱动通道的开放和关闭，因此连接S1-S4 VSD和PD的S4-S5 linker以及其与S6之间相互作用的方式对于通道的电-机械偶联至关重要。研究者认为，在Kv2.1中，F412参与形成的疏水相互作用可能能够有效地将S4螺旋、S4-S5 linker的运动与孔道两侧S6的运动偶联在一起，从而促进孔道的开放，这一构想也在电生理实验中得到了一定程度上的证明 (图5)。
图5. F412在通道失活中发挥关键作用
为了进一步理解Kv2.1失活的结构基础，研究者试图使用冷冻电镜对F412L突变的结构进行解析，然而2D分类中并未出现具备Kv2.1特征的类别，因而在结构解析中，研究者选择了在电生理上具有促进失活效果的L403A突变。通过后续数据处理，发现约80%的颗粒为激活-开放状态，而约20%的颗粒在3D分类中呈现出内部孔道关闭的独特构象。通过进一步数据处理，研究者获得了一个整体分辨率为3.3 Å的密度图。L403突变的整体结构与Kv2.1相似，VSD处于激活状态，且离子选择性过滤器中可见强电子密度，然而，L403的4个亚基却存在构象上的差异，尤其是在参与形成孔道的S4-S5 linker和S6部分 (图6)。
在4个亚基中，构象与开放状态相差最大的Chain D被称为“最失活亚基 (the most inactivated protomer)”，其S6存在3处于开放状态明显不同的结构特征：①开放状态中保守的PXP基序 (PIP, 404-406) 在L403中由弯曲变直；②PXP基序的变化导致S6发生约45°的旋转，导致孔道被I401和I405堵塞；③S4-S5 linker向孔道中心发生约2.5 Å的位移，破坏了其于F412之间的相互作用。
图6. L403A的4个亚基存在构象变化
综上，本研究揭示了Kv2.1通道在nanodisc中的结构，结合对一系列致病突变的功能研究，揭示了F412L在通道失活中的关键作用。此外，研究者还发现了另一个导致癫痫性脑病的突变对通道电压激活和失活特性的影响，这些结果揭示了Kv2.1通道结构与功能之间的关系，为理解其在神经元以及胰岛细胞中的生理功能，以及致癫痫性脑病导致疾病发生的机制提供了重要的信息。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-023-06582-8
参考文献
参考文献
1. Jan, L. Y. & Jan, Y. N. Voltage-gated potassium channels and the diversity of electrical signalling. J. Physiol. 590, 2591–2599 (2012).
2. Gonzalez, Carlos & Baez-Nieto, David & Valencia, Ignacio & Oyarzún, Ingrid & Rojas, Patricio & Naranjo, David & Latorre, Ramón. K+ Channels: Function-Structural Overview. Comprehensive Physiology. 2. 2087-149 (2012).
3. Misonou, H., Mohapatra, D. P. & Trimmer, J. S. Kv2.1: a voltage-gated K+ channel critical to dynamic control of neuronal excitability. Neurotoxicology 26, 743–752 (2005).
4. Herrington, J. et al. Blockers of the delayed-rectifier potassium current in pancreatic beta-cells enhance glucose-dependent insulin secretion. Diabetes 55, 1034–1042 (2006).
5.Thiffault, I. et al. A novel epileptic encephalopathy mutation in KCNB1 disrupts Kv2.1 ion selectivity, expression, and localization. J. Gen. Physiol. 146, 399–410 (2015).
6.Speca, D. J. et al. Deletion of the Kv2.1 delayed rectifier potassium channel leads to neuronal and behavioral hyperexcitability. Genes Brain Behav 13, 394–408 (2014).
7.Klemic, K. G., Shieh, C. C., Kirsch, G. E. & Jones, S. W. Inactivation of Kv2.1 potassium channels. Biophys. J. 74, 1779–1789 (1998).
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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