Cell | TAAR1结构和信号传导机制帮助优化激动剂设计

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痕量胺（trace amines）是一类与经典的生物胺结构类似的内源性物质，它的稳态失调与抑郁症、偏头痛和其他精神疾病密切相关。TAARs（trace amine-associated receptors）是能够识别这些痕量胺的受体。TAAR 可识别一系列的内源性含胺激素或代谢物（EAH 或 EAM），根据序列相似性、进化压力和配体选择性，可分成3组：I、II 和 III。值得注意的是，从进化的角度来看，TAAR 是从单胺 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 进化而来的（图1A），它在奖励、情绪提升和战斗或逃跑行为中发挥着重要作用。

2023年11月22日，来自山东大学的PAN SHANG等研究员在CELL发表了一篇’ Structural and signalling mechanisms of TAAR1 enabled preferential agonist design’的论文，此研究为TAAR1的分子识别提供了结构和信号框架，更为TAAR1靶向候选化合物的设计提供了结构模板和信号线索。

TAAR1的激活可以带来多种有益的影响，包括但不限于改善认知、情绪和注意力以及抗抑郁和抗成瘾影响。之前的研究证明了 TAAR1 能够感知多种 EAH 或 EAM，例如 β-苯乙胺 (PEA) 和对酪胺 (TYR)。TAAR1 激活引发的cAMP和 β-arrestin2 信号经证明可调节许多神经元和心理功能。重要的是，为了减少认知障碍、快感缺失和体重增加，以及当前针对 D2 多巴胺受体 (D2R) 或 5-羟色胺 2A 型受体 (5-HT 2A R ），进行高通量表型小鼠行为筛选，最终得到SEP-363856（SEP），临床试验中阳性和阴性症状量表（PANSS）总分均有显着降低，因此SEP 可作为潜在的抗精神病候选药物。此外，除了 TAAR1 激动剂安非他明 (AMPH) 在注意力缺陷多动障碍 (ADHD) 中的潜在用途外，TAAR1 的激动剂还表现出治疗成瘾和睡眠障碍的潜力。在本研究中，为了加速TAAR1 配体的基于结构的设计，并了解 TAAR1 的天然配体识别和信号复杂性，研究者分析 TAAR1 的信号多样性并解析结构。揭示的TAAR1的结构和信号转导机制被用于开发靶向TAAR1的合成激动剂，具有优先信号传导特性。

图 1.mTAAR1/hTAAR1的配体多样性及其在精神分裂症中的相应功能

研究者通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）以1.1至3.0 Å的分辨率解析了hTAAR3-或mTAAR4-Gs/Gq复合物与SEP、TMA、PEA和CHA结合的结构（图2A）。通过计算分子动力学 （MD） 模拟和突变影响分析了 mTAAR1 口袋内的配体结合模式（图2）。每种配体仅使用一种结合模式进行进一步的结构分析（图2）。

图2.TAAR1复合物的整体结构

TAAR1配体（如TMA、CHA、PEA和SEP）的体积为73.3至167.9 ų 。TMA属于迄今为止报道的最小的单胺激素组，占口袋总体积的不到1/3。值得注意的是，识别TMA的口袋残基，包括来自TM3、TM6和TM7的残基，也包含这些解析结构中TAAR1其他配体的一级胺。因此，研究者将包含一级胺的口袋命名为一级胺识别口袋（PARP：Primary Amine Recognition Pocket）。

总共有3个疏水残基和3个极性残基构成PARP。在 PARP 内部，保守的 D102^3.32与TMA中心的胺，CHA和PEA的一级胺以及临床药物SEP形成氢键。Y291^7.43与 D102^3.32桥接以稳定潜在的氢键网络。在口袋底部，W261^6.48和 F264^6.51形成一个“双胞胎”拨动开关并直接接触配体（图3A-3C）。S106^3.36和 Y287^7.39形成了范德华的相互作用力。与这些观察结果一致，PARP中残基的突变显着减少或消除了mTAAR1在这些激动剂下的激活（图2D-2G）

配体口袋的结构比较表明，TAAR1 的 PARP 明显小于其他识别 EAH 的 GPCR，这可能是由于 疏水效应堆积在 TM3 中T99^3.29 和I103^3.33 之间，在 ECL2中的P183ECL2和 F185ECL2之间和 在TM7中 的Y287 ^7.39。特别是 I103^3.33，P183 ^ECL2和 Y287^7.39 构成配体口袋葫芦形状中的“瓶颈”。研究者推测这种特定的疏水性堆积可能会限制PARP的大小，并作为TAAR识别小痕量胺的决定因素之一。

图3：一级胺识别口袋和第二结合口袋

与仅占据PARP的TMA结构相比，CHA、PEA和SEP激动剂结构中具有额外的环状结构，揭示了“第二结合口袋（Second Binding Pocket）”（图3A-3C）。SBP被CHA、PEA或SEP的碳环结构分成两半，一侧是P183^ECL2， F185 ^ECL2， I103^3.33、S106^3.36、S107^3.37和 Y153^4.56, 而另一侧是 S197^5.46， F265^6.52和 T268^6.55（图3A，3B）。残疾突变Y153^4.56A, P183^ECL2A, F185 ^ECL2A和F265^6.52A显著降低了mTAAR1在PEA或SEP刺激下的活性（图2F,2G），因此mTAAR1 的碳环和 SBP 之间主要由疏水性的相互作用形成。。值得注意的是，极性基团的存在如S106^3.36，S107^3.37，Y153^4.56和S197^5.46表明了设计具有极性基团的 mTAAR1 配体，通过极性基团可以与 SBP 的这些特定残基形成相互作用，是潜在的方案。

SEP是TAAR成员中TAAR1的选择性激动剂。在mTAAR1配体口袋中与SEP接触的12个残基中，至少有6个残基在Clade 1 TAARs并不保守（图3D）。重要的是，这六个残基突变为其他Clade I TAAR成员或其他单胺的结构等效残基，在SEP刺激下显示降低或严重损害了TAAR1活性（图3E）。而 F264^6.51和 Y287^7.39位于 PARP， I103^3.33，P183^ECL2和 S197^5.46是 SBP 的组成部分（图3A,3B）。因此，TAAR1 的 PARP 和 SBP 残基是 SEP 特异性识别的原因。

与Gq特异性激动剂CHA相比，两种Gs选择性激动剂SEP和PEA形成额外的接触，其中包括残基S106^3.36，Y153^4.56，P183页^ECL2和 Y291^7.43 （图3C和4A）。重要的是，以下突变S106^3.36A，Y153^4.56A 或 P183^ECL2A 使 SEP 和 PEA 的 Gs 活性降低了 5 至 50 倍。突变Y291^7.43A更是完全消除了mTAAR1对SEP和PEA的Gs活性（图2F，2G）。然而，这四个残基的突变对 CHA 诱导的 mTAAR1 的 Gq 活性没有显着影响（图2E）。因此，激动剂与S106^3.36-Y291^7.43在 PARP中的相互作用，和激动剂与 Y153 ^4.56-P183^ECL2在SBP 中的相互作用可能有助于特异性 Gs 激活。

图4.mTAAR1 与 Gs 和 Gq 的偶联

接下来，研究者在mTAAR1配体结合口袋内进行了基于结构的多水平虚拟筛选策略，以鉴定小分子激动剂。研究者通过选择S106^3.36和 Y291^7.43作为‘区域连络点’来进行更有效的 Gs 偏向激动剂设计，和选择I103 ^3.33， F185^ECL2和 F265^6.52的相互作用用于开发具有 Gs 和 Gq 活性的 mTAAR1 激动剂。最初，研究者对400,000种不同化合物进行配体对接（图5A）。其中所得的 70,000 个排名靠前的化合物再进行基于对接的虚拟筛选和基于诱导拟合的虚拟筛选进一步验证。mTAAR1 与前 90 个化合物命中的相互作用继续通过基于最小化的分子力学表面积（MM-GB/SA） 进一步计算（图5A）。最后对最终结构的前 60 种化合物进行区域接触划分分析（图5B）。

图5.基于结构的虚拟筛选和候选化合物设计TAAR1激动剂

结果表明，五种联苯化合物仅在mTAAR1/hTAAR1过表达细胞中激活Gs，其中ZH8667最有效（图5C）。此外，ZH8651 被鉴定为 Gs 和 Gq 的双重 mTAAR1/hTAAR1 激动剂。此外，研究者发现化合物ZH8659仅激活mTAAR1 / hTAAR1的下游Gq（图5C）。

除了 Gs 和双重 Gs/Gq 激动剂外，研究者还获得了一种有效的 gq 选择性 mTAAR1 激动剂 ZH8659，它可以作为进一步评估 TAAR1 下游 Gq 功能的有用工具。研究者开发的化合物ZH8659和ZH8651（0.3,1和3mg / kg;预处理时间30分钟）在小鼠中抑制了由MK-801诱导的精神性运动性兴奋（hyperlocomotion），其效率与临床使用的药物SEP相似（图6A）。在此次测试中，ZH8667 在与 mTAAR1 结合后仅显示 Gs 活性，在研究测试中，与 ZH8651 相比显示出较少的有益效果。值得注意的是，单独使用SEP（3mg / kg）对基线运动(baseline locomotion)有显着抑制，这可能导致自发活动减少的潜在副作用。相比之下，ZH8659 或 ZH8651 的给药对基线运动没有减少（图6A），证明了高剂量 ZH8659 或 ZH8651 的给药的安全性。

图6.ZH8651 和 ZH8659 缓解了 MK-801 诱导的精神分裂症样表型

同时，研究者解析了与PEA和ZH1结合的hTAAR8651-Gs复合物的结构（图7）。PEA 与 mTAAR1 和 hTAAR1 的结合模式几乎相同，同时占据 PARP 和 SBP（图7A-E）。在配体口袋内共有10个残基形成PEA与hTAAR10和mTAAR1的直接连接，。配体口袋中 m/hTAAR1 之间的重要区别在于 Y153^4.56，P183^ECL2， A193^5.42和 Y287^7.39在 mTAAR1 中分别被在hTAAR1中的F154 ^4.56， V184^ECL2， T194^5.42和 I290^7.39替代（图7E）。对于研究者合成的化合物ZH8651，ZH8651与mTAAR1和hTAAR1的结合模式非常相似。研究者观察到一共有11个相同的残基在 hTAAR11 和 mTAAR1 配体口袋中与 ZH8651 形成直接接触，这与 ZH8651 诱导的 mTAAR1 和 hTAAR1 激活效果一致（图7C–7E）。这些结果可为未来开发靶向hTAAR1的候选化合物提供有用的信息。

图7：hTAAR1 和 mTAAR1 的口袋残基对比，确定了 TAAR1 口袋的四个残基，这些残基可能导致物种差异

综上，这个研究为理解TAAR1不同含胺激动剂的识别提供了结构和信号框架，以及优先TAAR1激动剂设计的结构模板。

研究的局限性

在CHA-mTAAR1-Gq复合物中，使用修饰的Gq（基于mini-Gs）代替野生型（WT）Gq。TAAR1结构与WT Gq复合物的未来解决方案将提供更准确的Gq信号转导信息。此外，在化合物设计方面，ZH1和ZH8651在体内的半衰期相对较短 （T1/2分别= 0.18和0.27 h），药代动力学性质需要进一步的改善。

供稿 | 王欢

审稿 | 黄隽豪

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

微信号：FRCBS-THU

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