Science | Ube3a——揭秘天使综合征和自闭症的共同密码

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Angelman综合征（天使综合征）的发病率为两万分之一，患者表现出智力障碍、言语缺失、癫痫及运动缺陷、睡眠缺陷和行为异常（如自闭症谱系障碍[Autism spectrum disorder, ASD]、进食障碍、睡眠障碍等）¹。不过，患者们总是常常面露笑容，有天使般的神态。巧合的是，首先发现该疾病，并系统描述它的医生Harry Angelman，其名字里也有“天使”一词，故得名天使综合征。遗传学研究证实进化上保守的E3泛素连接酶Ube3a是Angelman综合征的致病因素²。

UBE3A蛋白（Ubiquitin-protein ligase 3A）就是E6AP蛋白，是泛素蛋白连接酶3型的一种。泛素-蛋白溶酶体是生物体内降解蛋白质的两种途径之一，另一种是自噬-溶酶体途径。Ube3a就负责将活化的泛素连接到即将被降解的蛋白质上。当然，蛋白质种类繁多，很容易就猜到，这个连接酶一定是有特异性识别功能的。Ube3a是众多连接酶中的一种，但目前，其关键靶向仍然未知。此外，功能Ube3a的缺失会损害发育突触的可塑性；相反，如果Ube3a基因座内拷贝数变化而增加的Ube3a剂量又会导致自闭症谱系障碍 (ASD)³ ，这通常与突触传递受损有关。截至目前为止，人们对Ube3a的突触前功能知之甚少，包括突触前Ube3a的调节失调是否导致Angelman综合征和ASDS的突触缺陷。

2023年9月14日，日本东京大学Kazuo Emoto实验室在Science期刊上发表了题为Presynaptic Ube3a E3 ligase promotes synapse elimination through down-regulation of BMP signaling的论文。研究者首次发现发育中的突触消除需要果蝇神经元中突触前Ube3a的活性，并进一步确定了Ube3a的结构域，该结构域是Ube3a与Kinesin运动蛋白相互作用所必需的。与Angelman综合征相关的相互作用区域错义突变减弱了Ube3a的突触前靶向，并阻止了突触的消除。相反，突触前的Ube3a活性增加会导致过早地突触消除，并损害突触传递。本文揭示了Ube3a的生理作用，并提示了与Ube3a失调相关的潜在致病机制。

图1

果蝇IV类树突树枝感觉神经元 (C4da) 支配体壁上的树突分支，同时向腹神经索 (VNC) 投射轴突，与二级神经元形成突触接触（图1A）。C4da神经元已被用来研究树突重塑的分子机制，因为它们在蛹形成后24小时内进行树突修剪，然后在蛹后期再生成虫特有的树突。研究表明，C4da神经元在变态过程中重塑轴突和树突。为了同时显示C4da神经元中的轴突和树突。研究者使用mCherry标记了C4da突触前端上的轴突；使用GFP标价了突触后的树突（图1，视频1，视频2）。

视频 1 三龄幼虫轴突末端C4da预突触的三维重建

视频 2 24小时APF时轴突末端C4da预突触的三维重建

以往的研究发现，C4da神经元的树突修剪需要多种分子，研究者测试了参与树突分支局部降解的成分，发现只有E1泛素激活酶Uba1是突触前消除和树突修剪所必需的。由于Uba1与Cullin1 E3连接酶在树突修剪中起作用，研究者接下来在C4da神经元中对Cullin1进行了RNAi抑制，发现Cullin1对于树突修剪是必要的，提示不同的E3连接酶可能在树突修剪和突触消除中起作用（图2A, B）。此外，研究者对参与轴突消除的E3连接酶进行了RNAi筛选，研究发现，C4da特异性抑制Ube3a引起严重的轴突消除缺陷，而不影响树突修剪。两个独立的Ube3a零等位基因也观察到了类似的突触前消除缺陷。此外，野生型Ube3a的C4da神经元特异性表达，而不是催化失活的Ube3a (Ube3a C941A)，回补了Ube3a突变体中的轴突消除缺陷（图2C, D），证实了Ube3a E3连接酶在C4da神经元中以细胞自主的方式作用于促进轴突消除（图2e）。

图 2 Ube3a是C4da神经元轴突消除所必需的

在不影响树突修剪的情况下，Ube3a是如何在轴突消除中发挥特殊作用的呢？研究者对Ube3a进行了亚细胞定位，发现Ube3a主要定位于C4da突触前的轴突，而在树突中没有明显的表达（图3A，B）。对C4da轴突中的Ube3a实时成像显示，Ube3a以恒定的速度从胞体向轴突末端顺行运输。这一运输速度（平均483.8 nm/S）在运动蛋白介导的轴突运输的范围内。如果用RNAi抑制运动蛋白重链 (khc) 则会影响Ube3a的突触前定位，且该神经元会表现出严重的轴突消除缺陷，表明Ube3a向轴突末端的运输依赖于运动蛋白（图3，视频3）。

视频 3 Ube3a::GFP在C4da神经元的轴突转运

图3

图 4 Angelman综合征相关突变减弱了Ube3a的轴突转运和突触前定位

Ube3a蛋白由多个功能域组成，但负责其突触前靶向的结构域仍然未知。为此，研究者构建了多个缺乏不同结构域的突变体，其中，缺失含有串联极性残基 (TPRs) 的中间结构域会完全抑制Ube3a在C4da突触前的定位，而已鉴定的果蝇Ube3a中间结构域及其附近所存在与Angelman综合征相关的错义突变D313V、V216G和I213T是保守的，这些突变也能明显干扰Ube3a-GFP的突触前定位（图4A-C）。考虑到Ube3a的转运依赖于驱动蛋白，研究者推断这些与Angelman综合征相关的中间结构域突变可能会影响Ube3a与运动蛋白的相互作用。为了验证这一猜想，研究者监测了Khc-GFP和Ube3a-Flag在C4da轴突中的共定位情况，发现D313V突变强烈减弱了两者的共定位（图4D、E）。这些数据表明影响Ube3a突触前定位的错义突变可能会损害突触可塑性并导致Angelman综合征。

图 5 Ube3a通过下调突触BMP信号传导促进突触消除

由于Ube3a介导的轴突消除需要其E3连接酶活性，因此Ube3a可能以突触前蛋白为靶标进行蛋白酶体依赖的降解。在潜在的Ube3a靶点中，研究者发现骨形态发生蛋白 (BMP) 受体Thickvein (Tkv) 在C4da神经元中的过表达会导致严重的轴突消除缺陷。用GFP标记C4da神经元的突触前Tkv发现，突触消除过程中Tkv水平显著降低，而在敲除了Ube3a的细胞中，Tkv降低程度明显减弱，提示Ube3a至少部分通过下调突触BMP信号来促进C4da神经元的突触消除（图5）。  

图 6 突触前Ube3a活性的增加导致轴突过早消除并损害突触传递

除了Ube3a的缺失外，Ube3a的过表达与ASDS有关，但尚不清楚突触前Ube3a的活性增加是否可能导致体内突触功能障碍。为了解决这个问题，研究者过表达了野生型和突变型Ube3a，发现野生型Ube3a的过表达导致了三龄幼虫C4da严重的轴突消除。Ube3a过表达的2龄幼虫与野生型对照相比，突触前数量没有明显变化，这表明C4da神经元中Ube3a表达增加导致现有轴突的过早消除（图6）。                                           

综上所述，这项工作揭示了Ube3a在轴突消除中的作用及其突触前定位的分子机制，提示突触前Ube3a E3连接酶是调控突触数量和活性的关键因素。在正常的生理状态下，Ube3a在运动蛋白Kinesin的协同作用下由树突运输到轴突，在轴突端下调BMP信号来促进轴突的消除。当Ube3a蛋白异常过表达时，就会导致轴突的过早消除，并损害突触传递，导致ASD；反之，当Ube3a蛋白功能缺失就会导致轴突消除缺陷，导致Angelman综合征。考虑到Ube3a可能通过下调BMP来促进突触消除，那么靶向BMP信号传导途径可能是治疗干预ASD和Angelman综合征的潜在策略。

图 7 突触前Ube3a活性与突触结构和功能异常有关

原文链接

https://www.science.org/doi/10.1126/science.

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参考文献

参考文献

[1] K. Buiting, C. Williams, B. Horsthemke, Angelman syndrome—Insights into a rare neurogenetic disorder. Nat. Rev. Neurol.12, 584–593 (2016).

[2] A. M. Mabb, M. C. Judson, M. J. Zylka, B. D. Philpot, Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends Neurosci.34, 293–303 (2011).

[3] S. J. Lopez, D. J. Segal, J. M. LaSalle, UBE3A: An E3 ubiquitin ligase with genome-wide impact in neurodevelopmental disease. Front. Mol. Neurosci.11, 476 (2019)

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

微信号：FRCBS-THU

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