Nature | 探秘HIV-1 Env三聚体与CD4蛋白的奇妙互动
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HIV-1 Env糖蛋白是一种含有gp120和gp41亚基的高度糖基化的同源三聚体，能够介导病毒进入宿主细胞1。在病毒颗粒表面，Env可以呈现与可溶的天然Env三聚体外侧结构域中观察到的相似的关闭和融合前构象2。病毒的入侵始于gp120与宿主受体CD4的结合，病毒的CD4结合位点 (CD4-binding site, CD4bs) 位于Env顶端gp120的侧面3。这种结合会触发gp120的构象变化，暴露gp120 V3的共受体结合位点，而在融合前构象中，该位点被gp120 V1V2环掩盖3。共受体的结合导致进一步的构象变化，使gp41融合肽插入宿主细胞膜，从而启动病毒和宿主膜的融合2。
X射线晶体学和单颗粒冷冻电镜已经解析了可溶性HIV-1 Env在多种状态下的结构，包括关闭状态4、融合前状态2、CD43结合的开放状态，以及部分开放的中间状态等。然而，关于Env构象变化以及CD4在启动融合过程中的一个始终存在的问题是，在受体诱导的变化过程中，Env三聚体中的每个gp120/gp41亚基是协同还是单独发挥作用的。
2023年11月22日，来自加州理工学院的Pamela J. Bjorkman在Nature上在线发表了一篇题为Intermediate conformations of CD4-bound HIV-1 Env heterotrimers的科研论文，通过设计可以结合1个或2个CD4受体的可溶性Env异源三聚体，研究者解析了Env结合1个或2个CD4分子的单颗粒冷冻电镜结构，分辨率分别为3.4和3.9 Å。其中，结合1个CD4的Env以融合前构象存在，仅表现出细微的CD4诱导的构象上的变化。结合2个CD4分子会导致Env不对称地部分开放，其中gp120亚基表现出类似于开放 (结合CD4) 和阻塞-开放 (未结合CD4) 的构象，3个gp41亚基的构象互不相同彼此结构不同。
研究者首先构建了能够结合一个或两个CD4分子的Env三聚体，并分别命名未HT1和HT2。大致的设计思路如下：对HT1而言，研究者以20:1的比例共表达不携带亲和标签的、含有D368Rgp120突变 (减少CD4的结合5) 的BG505 SOSIP.664和携带亲和标签的BG505 SOSIP.664；对HT2而言，则以20:1的比例共表达无亲和标签的BG505 SOSIP.664和携带亲和标签的、含有D368Rgp120突变的BG505 SOSIP.664 (图1)。通过亲和纯化，并用ELISA对Env三聚体与CD4分子的结合情况进行检测，可发现野生型BG505与CD4的结合能力最强，BG505-D368Rgp120仅在高浓度时结合少量CD4，而BG505 HT1和BG505 HT2显示中等水平的结合，BG505 HT2的结合能力较BG505 HT1强。
图1. 三聚体设计策略
通过对BG505 HT1异源三聚体在CD4存在时的样品进行数据处理，研究者发现HT1异源三聚体储存在三种构象：I类中有1个CD4分子密度 (3.4 Å)、II类存在一强一弱2个CD4分子的密度 (4.2 Å)、 III类不含CD4密度 (3.2 Å)。没有与结合CD4分子对应的密度。在后续分析中，研究者只对I类CD4-HT1进行了重构。虽然结合了1个CD4分子，但I类HT1三聚体仍保持关闭构象 (图2b)，提示Env与1个CD4分子的相互作用不足以触发三聚体的开放。
通过比对I类CD4-HT1复合物和开放的BG505三聚体 (CD4-BG505复合物，PDB: 6CM3) 中gp120上CD4bs的表面积(buried surface area, BSA)，发现在CD4-BG505复合物中，V1V2的位移导致gp120上多了约200 Å2的BSA (图2c,d)。即在HT1与CD4结合时，Env-CD4界面基本保持不变，但V1V2的位移会导致gp120与CD4的进一步接触。
图2. Env三聚体结合单个CD4分子的整体结构
CD4诱导的Env构象变化部分是由于Phe43CD4插入gp120上的一个保守的疏水腔隙——Phe43腔所导致的。为了探究1个Phe43CD4插入I类CD4-HT1复合物Phe43腔所产生的影响，研究者将该结构与另外两个Env三聚体复合物的结构进行比对，此处所选的结构分别为CD4bs bNAb结合的关闭、融合前构象和CD4结合的完全开放状态的BG505。结果发现，虽然I类CD4-HT1复合物中Env三聚体整体上与关闭的融合前构象相似，但Phe43腔内则表现出类似于CD4结合的构象变化 (图3)。
图3. Phe43腔内的CD4结合情况
在对BG505 HT2与CD4的样品进行数据处理时，研究者在分类中得到了3个类别的密度图：其中I类结合2个CD4分子 (3.9 Å)、II类结合1个CD4分子 (3.8 Å，类似I类CD4-HT1)、III类虽结合2个CD4分子，但CD4密度较差。I类CD4-HT2中的gp120与典型的CD4诱导开放构象相似，V1V2环从Env顶端移至gp120侧面，V3环暴露，无CD4结合的gp120则未出现类似的变化。相通过测量原体间Cα原子的距离，研究者对I类CD4-HT2中gp120的重排进行了量化：2个结合CD4的gp120 (Protomer A和Protomer B) 之间距离与CD4结合的开放的Env保持一致，而结合CD4的gp120与未结合CD4的gp120 (Protomer C) 之间的距离则小于CD4结合的、开放的Env三聚体中gp120彼此之间的距离 (图4b)。
图4. I类CD4-HT2整体结构及gp120重排
三股β-strand过渡为4股β-strand是CD4诱导gp120发生构象变化的标志3，为进一步了解I类CD4-HT2所代表的意义，研究者对其中β-strand的状态进行了进一步分析。在结合CD4的2个gp120中，可以观察到4股β-strand，而在未结合CD4的gp120中，β-strand则仍未3股 (图5)。2个CD4与BG505 HT2的结合导致形成了一个不对称且部分开放的Env三聚体，由2个处于CD4结合的开放状态的gp120和1个处于无CD4结合状态的、阻塞-开放状态的gp120共同组成。
图5. β-sheet变化情况
病毒与宿主细胞膜的融合由HIV-1 gp41亚基介导，在融合前，gp41由一个长的、由gp120顶部下方延伸出的HR1螺旋以及一个环绕HR1螺旋和融合肽以及融合肽近端区域 (fusion peptide proximal region, FPPR) 氨基末端的HR2螺旋组成。CD4的结合导致HR1 C端 (HR1c) 变得紧凑，在共受体结合后形成一个前发夹中间体，HR1从HR2和病毒包膜处延伸出来。这些变化导致FPPR螺旋变得紧凑，此外，融合肽由α-helix向无序的环状结构进行转变1。
一些研究表明，gp120的构象变化可能与gp41的变化相关，gp120和gp41之间存在协同作用。在关闭状态和开放状态的Env中，gp41经历了上述CD4诱导的变化 (图6)。在I类CD4-HT1复合物中，gp41与关闭状态Env三聚体中gp41类似，唯一的不同之处在于，在每个原体中，融合肽都是无序的。而在I类CD4-HT2复合物中，每个gp41都采取了不同的构象：Protomer A中gp41 HR1螺旋倾斜，HR1c呈短螺旋，FPPR弯曲且融合肽无序；在Protomer B中，HR1完全直立，HR1c完全延展，融合肽与FPPR则类似于闭合状态；对Protomer C而言，虽然没有CD4结合，但其gp41的构象却于CD4诱导的构象最为相似 (图5)。
图6. gp41的构象变化
在Nature同期online的另一项工作中，研究者利用cryo-ET对膜原位的CD4以及Env三聚体形成的复合物进行了分析（Nature | Cryo-ET揭示HIV-1 Env结合宿主CD4分子的中间状态）。在本研究中，研究者将得到的结构与之进行了进一步的比对。
与可溶性I类CD4-HT1复合物中观察到的关闭的Env构象不同，膜原位的Env在结合单个CD4分子时采取部分开放的构想状态。进一步分析发现，前述II类CD4-HT1复合物的密度则可以与cryo-ET的结果良好吻合 (图7)。对于可溶性I类CD4-HT2复合物而言，其密度与cryo-ET得到的结合2个CD4分子的Env三聚体密度良好吻合，然而，由于V1V2和V3区域具有较大的柔性，在cryo-ET中未被良好解析，研究者并未能够对该部分进行进一步的比较。
图7. I类CD4-HT2与cryo-ET解析的原位结构
这一问题的解决可以回答需要多少CD4受体和CCR5共受体与Env三聚体相互作用以启动膜融合的问题，并进一步解释与病毒传染性相关的Env功能，从而为抑制剂和抗体的设计提供更进一步的信息。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-023-06639-8
参考文献
参考文献
1.Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology 479–480, 498–507 (2015).
2.Lyumkis, D. et al. Cryo-EM structure of a fully glycosylated soluble cleaved HIV-1 envelope trimer. Science 342, 1484–1490 (2013).
3.Ozorowski, G. et al. Open and closed structures reveal allostery and pliability in the HIV-1 envelope spike. Nature 547, 360–363 (2017).
4.Sanders, R. W. et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog. 9, e1003618 (2013).
5.Sanders, R. W. et al. HIV-1 neutralizing antibodies induced by native-like envelope trimers. Science 349, aac4223 (2015).
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
微信号：FRCBS-THU
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