Cell | 早期胚胎发育与卵母细胞的蛋白储存宝库
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在受精发生后，来自母系的蛋白需要对合子进行基因重编程，在此基础上，胚胎的进一步发育才能够发生1。过去的研究表明，细胞内的蛋白可以以膜包裹或形成多聚体的方式进行储存。譬如，在卵生动物中，卵黄蛋白可以被包括在卵黄囊中2，植物的种子则可以将蛋白贮存在液泡中以备萌发之需3。对酵母和哺乳动物的一些体细胞而言，在营养不足或应激状态下，为了避免遭受降解，细胞内的酶会形成多聚体，在应激状态解除后再行解聚4。
早在上世纪60年代，在针对卵母细胞进行研究时，研究者们观察到了一种在细胞内高度富集的结构——胞质网格 (cytoplasmic lattice) (图1)5。关于其功能的猜测众说纷纭，有人认为其与卵黄囊存在关联，也有人认为它是核糖体形成的阵列，是卵母细胞的核糖体储备库6，此外，还有研究认为这是一种卵母细胞所特有的中间丝7。21世纪早期，一些研究发现，卵母细胞特异性的蛋白参与了胞质网格的形成，其中包括PADI6 (peptidylarginine deiminase 6) 和SCMC (subcortical maternal complex) 等，PADI6和SCMC的缺失会抑制胞质网格的形成以及胚胎发生，而这两者的突变也与人类不孕密切相关8。然而，这些蛋白与胞质网格的关系一直是个谜。
图1. 早期研究观察到的胞质网格结构5
2023年11月2日，来自德国马克斯普朗克研究所的Melina Schuh在Cell上在线发表了一篇题为Mammalian oocytes store proteins for the early embryo on cytoplasmic lattices的科研论文，利用超分辨荧光成像和冷冻电子断层扫描技术，揭示了胞质网格在卵母细胞蛋白储存中的关键作用 (图2)。
图2. 胞质网格在卵母细胞蛋白的储存中发挥关键作用
在过去的光镜研究中，PADI6和SCMC在卵母细胞的皮质呈弥散分布，具体定位并不明确。为了进一步阐明二者的分布，研究者在小鼠的Padi6基因中敲入了HaloTag，并使用超分辨成像对其定位进行分析，发现PADI6不仅分布在卵母细胞和植入前胚胎的皮质下区域，在整个胞质中都广泛存在，其表达水平在囊胚期达到最低 (图3)。此外，通过显微注射将编码Halo-PADI6以及带有HaloTag的SCMC报告蛋白 (TLE6、OOEP、KHDC3) 等的mRNA注射到卵母细胞中，可以观察到与在基因编辑鼠中相同的亚细胞定位。
图3. Halo-PADI6在卵母细胞以及植入前胚胎中的定位
在此基础上，研究者进一步分析了PADI6与SCMC在三维空间中的分布。为了在更高分辨率的尺度上对此类的小结构进行光镜研究，研究者采用了膨胀显微成像技术 (expansion microscopy, ExM)。被膨胀的卵母细胞带有PADI6或SCMC组分TLE6、NLRP5、OOEP以及KHDC3的标记，PADI6和SCMC组分在细胞中呈纤维状排布，遍布整个细胞质，并且彼此之间存在共定位 (图4)。
图4. PADI6以及SCMC组分在空间分布上存在共定位
此外，为了获得更高的轴向分辨率，研究者进一步结合STED技术对卵母细胞进行膨胀显微成像 (ExSTED)，发现PADI6/SCMC形成为纤维宽约100 nm，平均长度达700 nm左右 (图5)，该数据与小鼠卵母细胞中胞质网格2D电镜成像所获得的数据良好吻合。
图5. ExSTED采集得到的三维成像结果
鉴于PADI6/SCMC纤维与胞质网格在分布上的相似性以及功能上的相关性，研究者进一步追问，PADI6/SCMC纤维与胞质网格是否为相同的结构呢？通过对处于生发泡期的小鼠卵母细胞进行抗PADI6抗体和荧光偶联NHS酯 (NHS酯可以结合蛋白的伯胺，因而细胞中富含蛋白的区域会被标记) 的双重标记，发现PADI6与细胞内富含蛋白的区域 (胞质网格区域) 高度重合，而在敲除了Padi6和Tle6的卵母细胞中 (胞质网格结构无法形成)，这种富含蛋白的纤维状结构不复存在 (图6)。
图6. PADI6染色与胞质网格染色区域高度重合
通过常温电子断层扫描 (room temperature electron tomography, RE-ET) 进一步对胞质网格进行三维成像，可见胞质网格的纤维占胞质体积的约10%，该结构由许多更短、带分支的纤维丝组成，这些短纤维丝的长度约在200 nm左右。纤维丝彼此之间堆叠，形成螺旋状结构。在横截面上，每根纤维可由5~40根纤维丝组成。在进一步冷冻电子断层扫描的结果中，纤维丝呈现出38 nm的周期性排布，子断层平均可以得到一个整体分辨率约为30 Å，纤维丝在整体上呈椭圆形，长径为40 nm，短径为31 nm (图7)，过去认为胞质网格由核糖体组成的观点自此不攻自破。
图7. 胞质网格的RE-ET和cryo-ET子断层平均结果
为更深入地探究PADI6和SCMC在卵母细胞中的功能，研究者对野生型和Tle6-/-、Padi6-/-小鼠的卵母细胞进行了定量质谱分析。质谱结果提示，在基因敲除鼠中，大量蛋白表现出了丰度的显著降低，然而对应的转录本丰度并未出现明显的变化。在数据库中，这些蛋白有很大一部分注释为“maternal RNA”，极有可能是来源于母系、储存在卵母细胞中的蛋白。在使用STRING进行通路富集分析时，发现Padi6-/-和Tle6-/-卵母细胞中减少的蛋白在功能上是相互重叠的，其中很大一部分是在早期胚胎发生过程中促进发育的母系因子 (图8)。
图7. 定量质谱STRING通路分析结果
至此，在阐明了诸多相关性之后，仍有一个至关重要的问题未得到说明，即在人的卵母细胞中，胞质网格这一结构是否也由PADI6和SCMC组成呢？研究者继续利用抗体和荧光标记的NHS酯对生发泡期的人卵母细胞进行标记，以对PADI6和SCMC的不同组分进行检测。结果显示，在人的卵母细胞中，PADI6和胞质网格存在显著共定位 (图9)，且TLE6、PADI6、NLRP5也存在显著共定位，提示人卵母细胞的胞质网格由PADI6和SCMC共同组成。
在临床上，携带PADI6或SCMC基因突变的孕妇通常会出现胚胎在发育早期停滞的现象，且PADI6、NLRP5、OOEP和KHDC3L等基因的突变会导致后代基因印记异常，此前尚不清楚这些突变是如何导致异常表型发生的。研究者发现，在Padi6-/-小鼠卵母细胞中DNA甲基化酶UHRF1缺失严重，而该甲基化酶在胚胎发育早期发挥重要的作用，进一步探究发现该酶在正常的人卵母细胞中也高度富集，并与PADI6存在共定位。至此，研究者认为，胞质网格存在储存UHRF1的作用，胞质网格相关的突变会导致UHRF1的表达水平或细胞定位发生改变，从而导致后代基因印记异常，导致疾病的发生或胚胎发育的停滞。
图9. 人卵母细胞中PADI6与胞质网格共定位
综上，本文研究揭示了卵母细胞胞质网格结构能够储存并富集大量蛋白，对胚胎的发育发挥至关重要的支持作用。在受精后，受精卵以及早期胚胎需要大量的蛋白来启动基因的重编程、进行后续的发育，通过胞质网格对关键蛋白进行储备，卵母细胞可以即使相应后续胚胎发育对于关键蛋白的需求。
原文链接
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)01085-1
参考文献
参考文献
1.Li, L., Zheng, P., and Dean, J. (2010). Maternal control of early mouse development. Development 137, 859–870.
2. Romano, M., Rosanova, P., Anteo, C., and Limatola, E. (2004). Vertebrate yolk proteins: a review. Mol. Reprod. Dev. 69, 109–116.
3.Herman, E.M., and Larkins, B.A. (1999). Protein storage bodies and vacuoles. Plant Cell 11, 601–614.
4.Prouteau, M., Desfosses, A., Sieben, C., Bourgoint, C., Mozaffari, N.L., Demurtas, D., Mitra, A.K., Guichard, P., Manley, S., and Loewith, R. (2017). TORC1 organized in inhibited domains (TOROIDs) regulate TORC1 activity. Nature 550, 265–269.
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8.Li, L., Baibakov, B., and Dean, J. (2008). A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell 15, 416–425.
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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