Cell Sys｜基于相分离实现亚显微蛋白簇的简单可视化
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蛋白质聚集在细胞生理和疾病中发挥着重要作用。深入了解蛋白质聚集发生的时间和地点，不仅可以更清楚地描绘细胞组织和功能的全貌，还可以提供新的调控节点来通过调节聚集控制细胞行为。然而，蛋白质寡聚体通常难以检测，因为它们往往太小，无法通过光学显微镜观察。来自宾夕法尼亚大学的研究团队在《Cell System》上发表了名为“Simple visualization of submicroscopic protein clusters with a phase-separation-based fluorescent reporter”的文章，文章中介绍了一种能高灵敏检测蛋白质聚集的新型荧光策略CluMPS（通过相分离来放大簇）。CluMPS可以检测并视觉上放大微小聚集，产生可以通过标准显微镜检测到的大型荧光凝聚体。CluMPS是多价的，并且对目标蛋白质具有亲和力。如果目标蛋白质发生聚集，CluMPS 和目标蛋白质会一起凝结形成大的荧光斑点。否则，CluMPS 会保持弥散状态（图1A）。
CluMPS 由三个域组成：(1) 一个目标蛋白质的结合域，(2) 一个荧光蛋白，以及 (3) 一个提供多价性的放大域（图1B）。研究者们通过测试不同的放大域组成来优化系统结合小聚集体的能力。他们测试了两种多聚螺旋（六聚体的 HOTag3 和四聚体的 HOTag6）以及三种无序区片段（IDRs: FUS(LC), LAF-1 RGG, Xvelo），使用GFP 结合纳米抗体 LaG17 作为结合域去靶向GFP微聚集体，通过光遗传的方法诱导GFP聚集来评估候选CluMPS 设计的性能。他们将 GFP 与 Cry2 融合，Cry2 在蓝光刺激下会形成聚集体（图1C）。Cry2 聚集体的大小取决于其浓度。当 Cry2-GFP 表达水平高时，会形成大的可见聚集体，而在低表达细胞中，聚集体太小，无法超越弥散荧光背景而被观察到（图1D 和 1E）。这种不可见的小聚集体为 CluMPS 的放大提供了理想的测试案例。
当单独表达或与 Cry2-GFP 在黑暗中共表达候选 CluMPS 变体时，所有的 CluMPS 变体都显示出弥散的表达（图1F顶部）。光刺激后，带有无序区片段的 CluMPS 变体表现出较少或没有相分离，接近阴性对照。具有多聚放大域（HOTag3 或 HOTag6）的构建体在受到光刺激 Cry2-GFP 聚集时，在几秒钟内形成了大的凝聚体（图1F）。在所有 Cry2-GFP 浓度下都可以观察到 CluMPS 聚集（图1G）。
图1. CluMPS可以放大小的蛋白寡聚体
为了理解控制CluMPS的关键原理，研究者建立了一个蛋白质聚集的动力学蒙特卡罗模型，以模拟两种多价物——“目标”和“报告器”（CluMPS）之间的相互作用（图2A和2B）。
他们模拟了目标和报告器在四个系统参数下的空间分布随时间的变化：(1) 结合能ΔE，(2) 目标聚集体的大小，(3) 聚集的目标比例，因为蛋白质聚集体在细胞内可能以多种尺寸存在，以及(4) 目标和报告器的浓度（图2C）并发现CluMPS凝聚对目标和报告器的相对浓度很敏感，凝聚体在目标和报告器的数量大致相等时最为稳定。
图2. CluMPS系统的模拟模型及其在不同参数下的行为
为了确定 CluMPS 是否能够增强对已知蛋白质寡聚体的可视化效果，研究者测试了它是否可以检测和放大一些与疾病相关的蛋白质的小聚集体。这些目标蛋白与 GFP 融合，以便与 LaG17-CluMPS共同放大。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的核衣壳蛋白（N）自身能够发生相分离。然而，GFP-N 融合蛋白在 HEK293T 细胞中表现为弥散状态，但是与 LaG17-CluMPS 共表达时，观察到 GFP-N 和报告器形成了微米级的聚集体，并且在所有细胞中均有出现（图3A–3C）。
接着，研究者测试了 CluMPS 对 TDP-43 的放大效果。由于 TDP-43 是一种核蛋白，他们在 LaG17-CluMPS 的C末端添加了一个核定位序列（NLS）。在 HEK293T 细胞中，GFP-TDP-43 表现为弥散状态，与 N-GFP 类似。然而，与核靶向的 LaG17-CluMPS 共表达后，TDP-43 凝聚体的检测率从约2%增加到约80%的细胞中，揭示了 GFP-TDP-43 的自聚趋势。（图3D–3F）。
最后，他们测试了 CluMPS 放大 EML4-ALK 凝聚体的能力。单独表达的 EML4-ALK-GFP 融合蛋白在约25%的转染 HEK293T 细胞中形成了聚集体，在其余的细胞中则表现为弥散状态。然而，与 LaG17-CluMPS 共表达时，几乎每个细胞中都出现了大的凝聚体（图3G–3I）。
图3. CluMPS检测病理蛋白的聚集
CluMPS可以用于检测内源性蛋白质的聚集，这通过使用未修饰目标的结合伙伴或在内源性位点标记感兴趣的蛋白质来实现。研究者首先通过设计一种 CluMPS来放大患者来源的 H3122 肺癌细胞中 EML4-ALK 致癌基因的凝聚体（图4A）。EML4-ALK 通过细胞质内聚集和ALK激酶结构域的自磷酸化驱动致癌信号传导，这会招募包括 Grb2 和 Gab1 在内的适配器蛋白来触发下游的生长信号（图4B）。因此，Gab1(PRD)-CluMPS 通过作为 EML4-ALK 凝聚体的标志来报告 Grb2 的凝聚情况。在 H3122 细胞中，他们观察到了 Gab1(PRD)-CluMPS 的大型凝聚体（图4C 和 4D）。
图4. CluMPS在检测内源性蛋白质聚集体中的应用
最后，研究者探讨了是否可以多重化CluMPS，以放大同一细胞中的不同聚集体。HOTag3和HOTag6都能作为强大的放大域（图1），但当共同表达时不会发生交叉相互作用。利用这个特点，研究者生成了一个基于HOTag6的CluMPS（图5A）。他们在细胞中共同表达了这两个构建体，分别针对两个不同的聚集目标：ALFA-Cry2（在细胞质中形成聚集）或BcLOV4-GFP（在膜上形成聚集）（图5B）。蓝光刺激触发了在mRuby和iRFP通道中出现的不同的凝聚体，反映了这两个不同的光遗传学聚集体的放大（图5C和5D）。这两个通道中的凝聚体没有重叠，膜相关的BcLOV4聚集体更为外周，而Cry2聚集体更为细胞质化，从而展示了使用正交CluMPS探针进行多重聚集体检测的能力（图5C和5E）。
图5. 正交CluMPS报告基因的多重成像
总体来说，CluMPS报告器通过放大小的蛋白质聚集体，实现高灵敏度的可视化，适用于检测广泛的聚集体类型和大小。它相比现有技术更为简单且具有高信噪比，不需要目标蛋白的过表达，因此能够在天然细胞环境中准确检测内源性聚集体的动态变化。但是CluMPS也存在局限性，如无法精确计算聚集体特征或干扰目标蛋白的聚集状态，以及无法准确判断目标蛋白的细胞定位，但它依然展示了巨大的潜力，特别是在药物筛选和病理性聚集体检测等领域。通过进一步的优化和验证，CluMPS有望拓展我们对蛋白质聚集体动态的理解。
供稿 | 吴其乐
审稿 | 朱辰旭
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲
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