The Innovation | 一石二鸟：生物3D打印梯度活性材料重建骨-软骨界面

导 读

当前全球人口老龄化形势严峻，老年退行性肌肉骨骼疾病已成为致残的魁首。骨-软骨损伤发病率高、危害性大。现有临床治疗手段单一、效果不佳。随着生物3D打印技术的快速发展，可从0到1地实现体外定制化构建，为器官再生甚至移植提供新策略。然而，真实器官缺损往往具有异质化的特征，例如关节软骨缺损往往伴随着软骨下骨丢失，其修复就涉及多组织再生联动的挑战，给生物3D打印体外构建仿生器官结构体带来巨大挑战。基于应用需求，生物3D打印构建“一石二鸟”差异性功效的活性材料一体化修复骨-软骨损伤具有重大意义。

图1 图文摘要

骨与软骨同处于关节微环境，但两者的结构组分和生物学特征具有显著差异。目前治疗手段难以实现二者损伤后的同步修复。生物3D打印技术为精确制造具有分层结构的活性骨-软骨(OC)单元一体化支架提供了可能。本研究受天然OC单元双层结构启发，采用双通道挤出式生物3D打印技术，结合功能生物墨水，分层包裹不同活性特征的两种细胞（关节软骨祖细胞(ACPC)和骨髓间充质干细胞(BMSC)），在温和的条件下制备出具有各向异性的双细胞活性水凝胶(ABLHs)支架。经验证，ABLHs能够在体外维持两种细胞的活性和分化能力，表现出支架生物学功能的空间特异性。此外，将ABLHs移植到兔膝关节OC缺损模型中，生成了仿生生理结构的OC界面，实现了关节软骨和软骨下骨的差异性一体化修复。据此，我们认为，依托生物3D打印技术，精确构建空间差异性的生物活性支架，有助于复杂组织结构的仿生重建和功能再现。

1. 生物墨水的选择和打印

经典生物墨水如甲基丙烯酸酐修饰的明胶（GelMA）的生物相容性好，但难以实现室温下的挤出成型；同样具有光敏性能的甲基丙烯酸酐修饰的海藻酸（AlgMA）的机械强度高，但缺少细胞黏附位点，不利于细胞存活。将两者混合制成不同比例的生物墨水，通过筛选其流变学参数、挤出线条形态和细胞存活率，发现7G3A生物墨水（7% GelMA + 3% AlgMA）兼具剪切致稀特征(图2A)、室温下适合挤出的模量(图2B)、快速光交联能力(图2C)、挤出线条连续光滑(图2D)、细胞存活率高于80%(图2E)的优势，因而被选择作为本研究的墨水材料，并通过挤出打印制备出分层负载双细胞支架(图2F&G)。

图2 复合生物墨水的打印性能探究

2. 体外细胞三维培养和成骨、成软骨分化表征

既往研究已证实ACPC具备成软骨分化潜能，而BMSC具备成骨分化潜能。因此两种细胞被选为种子细胞分别诱导软骨层和骨层的形成。体外三维培养证明，两种细胞在7G3A生物墨水中均能良好黏附、铺展、增殖，以及促进界面融合(图3)。ACPC成软骨分化过程中，软骨ECM组分（ECM，细胞外基质）Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达量逐渐增加(图4C&D)；成软骨正调控相关基因如Pthlh, Osrl和Sulf1/2表达上调，而Nog, Ccn4和Chadl等负调控相关基因表达下调(图4E)。BMSC成骨分化过程中，骨ECM组分Ⅰ型胶原和骨钙素表达量逐渐增加(图4I&J)；成骨正调控相关基因如Gli3, Ddr2和Bmp2/4/7等表达上调，负调控相关基因如Mdk, Hdac6和Greml表达下调(图4K)。

图3 7G3A复合墨水内部细胞的存活和增殖

图4 三维培养的ACPC和BMSC分别向软骨和骨分化的体外表征

3. ABLHs体内植入促进骨-软骨一体化修复

以新西兰大白兔为动物模型，构建股骨滑车处的OC缺损，分别做不同植入处理。术后6周，无植入物组的修复仅发生在主要由纤维结缔组织组成的软骨表面，无细胞水凝胶组显示出脆弱的软骨连接和空洞样骨结构。相比之下，载细胞水凝胶表现出相对完整的早期填充修复，这受益于外源干细胞分泌的各种活性细胞因子(图5A&6A)。术后12周，载细胞组中软骨和软骨下骨层均实现良好重建，其中ABLH植入不仅能诱导软骨下骨层的骨重塑，还能维持软骨层的完整性，提供适配的软骨和骨发育的生态位。重要的是，软骨和软骨下骨层分别高表达各自的生物标志物，且在软骨-骨界面处呈现出清晰的分界现象(图5E&6E)。

图5 体内修复的软骨层表征

图6 体内修复的软骨下骨层表征

4. 软骨-骨-血管互作是实现骨-软骨同步修复的核心

为进一步探究ABLHs重建软骨层和骨层以及OC界面的内在机理，通过联合体外基因测序分析(图7A-E)和体内荧光定位染色(图7F&G)对修复过程中血管新生情况进行检测。结果表明，在修复软骨层和骨层的过程中血管生成差异调控OC一体化修复和界面再生。术后6周，细胞修复组 (BMSC, ACPC和ABLH)中的软骨下骨层出现H型血管高表达，而软骨层中几乎没有表达。这符合正常生理状态中H型血管的空间分布特性。术后12周，BMSC组中软骨下骨H型血管供应丰富，甚至迁移到软骨上层。而双细胞分层组(ABLH)中，H型血管被限制在软骨下骨层，不会穿透和扰乱软骨稳态，这对理想软骨-骨界面的实现至关重要。

图7 OC重建过程中的软骨-骨-血管互作表征

总结与展望

受OC单元天然层次结构的启发，本研究巧妙地构建了负载种子细胞的ABLHs。7G3A复合生物墨水能够直接室温打印成型，维持细胞增殖和定向谱系分化潜能。重要的是，原位植入ABLHs在体内OC缺陷模型中实现了软骨层和软骨下骨层差异性一体化重建。在机制上，软骨-骨-血管互作对ALBHs诱导的仿生OC单元重构至关重要。总之，本研究提出了一种基于干细胞的异质性双层水凝胶生物构建策略，为有效修复OC损伤提供了一种全新的方法。

责任编辑

宋恩名  复旦大学

曹   逊   中国科学院上海硅酸盐研究所

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(23)00170-4

本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第五卷第一期以Report发表的“3D-bioprinted anisotropic bicellular living hydrogels boost osteochondral regeneration via reconstruction of cartilage–bone interface” (投稿: 2023-07-27；接收: 2023-11-17；在线刊出: 2023-11-20)。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2023.100542

引用格式：Zhang Y., Li D., Liu Y., et al., (2024). 3D-bioprinted anisotropic bicellular living hydrogels boost osteochondral regeneration via reconstruction of cartilage–bone interface. The Innovation 5(1), 100542.

作者简介

阮长顺，中国科学院深圳先进技术研究院研究员/博士生导师，聚焦于生物3D打印器官体外精准制造与功能重建等前沿交叉研究，尤其在骨关节功能重建方面。先后承担国家自然科学基金优秀青年项目、科技部重点研发计划课题、中国科学院青年促进委员会优秀会员、广东省科技创新青年拨尖计划等项目。近年来，以通讯作者（含共同）发表30余篇，包括The Innovation、Adv. Funct. Mater.、Adv. Sci.、Bone Res.、Biomaterials、Bioact. Mater.、Research等；申报中国发明专利30余项，国际PCT专利6项，获发明专利授权15项，部分实现转化；担任中国生物材料学会生物材料先进制造分会秘书长、中国康复医学会修复重建外科专业委员会再生医学转化学组常务委员、中国医药生物技术协会3D打印分会委员等；担任生物制造领域国际期刊Bio-Des. Manuf 副主编。

朱雪松，苏州大学附属第一医院研究员/博士生导师，苏州大临床医学研究院副院长。江苏省“333”高层次人才培养工程第二层次培养对象（中青年领军人才），江苏省医学重点人才。长期聚焦骨与软骨退行性疾病的基础和临床治疗新策略开发。以通讯作者（含共同）发表SCI收录论文30余篇，包括The Innovation、Adv. Sci.、Bioact. Mater.、Biomaterials、J. Pineal Res.、J. Bone Miner. Res. 等。主持国家重点研发计划课题1项，国家自然科学基金4项。以主要完成人获国家科技进步二等奖 1 项，省部级科技一等奖 4 项。兼任中国康复医学会骨质疏松防治专委会青委副主委，中华医学会科研管理分会青委委员，中华医学会/中国医师协会骨科分会基础研究学组委员，SICOT 中国部基础研究学组常务委员，中国生物技术学会3D打印分会常委。

杨惠林，苏州大学附属第一医院骨科主任、大外科主任，苏州大学骨科研究所所长，国家重点学科及国家临床重点专科学科带头人。国务院学位委员会学科评议组成员（第六、七届），全国先进工作者（全国劳模）。连续多年入选斯坦福大学和Elsevier“全球前2%顶尖科学家”，“Elsevier中国高被引学者”榜单。以第一完成人获国家科技进步二等奖2项，省部级科学技术一等奖5项，何梁何利科学与技术进步奖。中华医学会理事会理事，中华骨科学分会常委、微创外科学组组长，中国康复医学会骨质疏松预防与康复专业委员会主任委员、脊柱脊髓专业委员会副主任委员，中国医师协会骨科医师分会常务委员，中国老年保健协会骨科微创分会会长，国际脊柱创新发展学会（ISASS）国际主席，亚太脊柱微创学会（PASMISS）主席（第十九届）。

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The Innovation是一本由青年科学家与Cell Press于2020年共同创办的综合性英文学术期刊：向科学界展示鼓舞人心的跨学科发现，鼓励研究人员专注于科学的本质和自由探索的初心。作者来自全球55个国家；已被139个国家作者引用；每期1/5-1/3通讯作者来自海外。目前有196位编委会成员，来自21个国家；50%编委来自海外(含39位各国院士)；领域覆盖全部自然科学。The Innovation已被DOAJ，ADS，Scopus，PubMed，ESCI，INSPEC，EI，中科院分区表(1区)等收录。2022年影响因子为33.1，CiteScore为23.6。秉承“好文章，多宣传”理念，The Innovation在海内外各平台推广作者文章。

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