免疫治疗丨免疫检查点抑制剂生物标志物之HLA
随着肿瘤免疫治疗时代的到来，免疫检查点抑制剂的研发和审批的进步，确保了免疫检查点抑制剂已经作为肿瘤治疗的新的有效方法之一。临床研究显示，单独使用PD-1抑制剂，只有20-40%的病人会对免疫治疗产生反应，医生很难知道免疫疗法是否对某个病人有效，如何筛选出这部分有应答的患者则是临床所面临及需要解决的问题 。（经典型霍奇金淋巴瘤是一个例外，单独使用，有效率高达80%以上）
有没有生物标志物（Biomarker）能够预测对免疫检查点抑制剂的反应？开发生物标志物对于帮助患者分层以及预估患者是否对免疫阻断单独疗法有反应，是否需要组合疗法或者接受其他的治疗是必要的。
精准医学始于靶向治疗，免疫治疗从一开始就在思考能否利用靶向治疗开辟新的成功路径。就目前而言，免疫治疗已经开辟了通向精准治疗的各种路径。
目前，影响 Immune checkpoint inhibitor（免疫检查点抑制剂）的有效生物标志物包括：PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen等，更多反映免疫疗效的生物标志物还在不断的研究与试验中。
今天我们聊聊HLA（Human Leukocyte Antigen，人类白细胞抗原），HLA又称为MHC（Major Histocompatibility Complex，主要组织相容性复合物），是存在于抗原呈递细胞表面负责抗原呈递的蛋白分子。上篇免疫治疗文章我们说到过新生抗原，新生抗原为什么可以预测免疫检查点抑制剂的疗效？那是因为它与HLA-1（MHC-1）结合后可以被呈递至细胞表面并将其传递给CD8+的T细胞，才能够激活CD8+细胞，进而杀伤肿瘤细胞。所以，免疫检查点抑制剂的治疗中，抗原呈递能力才是关键！
HLA背景介绍
HLA，通常称之为MHC分子或主要组织相容性复合物，位于人类6号染色体短臂6p21.3上长度约4.0M的区域内，包含超过200个基因。除同卵双生子以外几乎找不到HLA相同者，每个人的HLA千差万别，因此，HLA有人体生物学“身份证”之称。它是不同个体免疫细胞相互识别的标志，机体“区分敌我、识别自身、排除异已”的主要遗传标记，参与免疫应答反应，具有非常重要的生物学功能。
MHC基因产物在不同细胞表面表达，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。HLA主要包括HLA-I类、HLA-II类和HLA-III类三个区，因序列上高度可变，导致HLA等位基因数量异常庞大。
HLA-I类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C等，分布于几乎所有有核细胞表面，以淋巴细胞表面密度最大。HLA-II类基因包括HLA-D家族，主要有HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR等，主要分布于B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面。HLA-III类基因大约包含75个基因，大多数功能不明。
HLA-I类（MHC I）和II类（MHC II）基因是编码结合和呈递抗原的分子，使细胞毒性T淋巴细胞经抗原结合槽与成熟的HLA细胞表面蛋白结合，I类基因主要将抗原呈递给CD8+ T细胞，II类基因主要将抗原呈递给CD4+ T细胞。
T细胞受体（TCR）在识别APC细胞或者靶细胞上的MHC分子所提呈的抗原肽时，不仅识别抗原肽，还要识别与抗原肽结合的MHC分子类型。
HLA-I是细胞膜糖蛋白，由一条（重链）α链和一条（轻链）β2微球蛋白组成，重链分为胞浆区，跨膜区，胞外活性区（免疫球蛋白样区，肽结合区）。HLA-II是膜糖蛋白，由一条α多肽链和一条β多肽链组成。
HLA复合物是整个人类基因组中最多态性的区域，截至2018.05.05日，相关数据库（Release 3.32.0）显示有近18,181种不同的HLA等位基因。随着越来越多的新等位基因出现，该HLA等位基因名单将继续迅速扩大。每种HLA等位基因可表现出对同一新生抗原不同的亲和呈递能力，这也是目前流行的新生抗原预测的核心所在。详情参考：IPD-IMGT/HLA数据库：
https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html
HLA的命名
按照世界卫生组织HLA系统命名委员会2010年公布的等位基因命名原则，一个完整的HLA等位基因由8个数字和1个字母组成（Subtype也可能3位）。
比如上图的HLA-A* 24:02:01:02 L，其中“A”代表基因座位，“24”代表对应的血清学特异性，“02”代表编码区碱基取代并且氨基酸改变，“01”代表编码区碱基取代但氨基酸不变，第二个“02”代表内含子或非编码区碱基取代，最后的字母表示基因的蛋白表达状态（“L”代表该等位基因低表达，“N”表示该等位基因不表达，“S”表示该基因编码可溶性的分泌型蛋白，“C”表示该等位基因编码的产物存在于胞浆中，“A”表示异常表达的等位基因，“Q”表示有疑问而不能断定）。
备注：G组是由WHO HLA命名委员会确定和命名。G表示具有相同的第2、3外显子序列的一组HLA-I类等位基因或具有相同第2外显子序列的一组II类等位基因：如DRB1*12:01:01G包括了DRB1*12:01、DRB1*12:10。
HLA与免疫治疗
与肿瘤免疫检查点抑制剂相关的HLA类型主要是HLA-I类基因，CD8+ T细胞只有识别HLA I类分子呈递出来的短肽，才能够被激活。HLA I类分子主要包括HLA-A，HLA-B，HLA-C三类。
新生抗原那篇文章我们有说到肿瘤新生抗原的预测流程，新生抗原预测流程中最重要也是最核心的一部分就是确定HLA I类基因的亚型（HLA-A/HLA-B/HLA-C三类，分辨率达到中高分辨率就可以），然后通过软件预测突变多肽与HLA的亲和力（常看IC50值，代表与50%的等位基因所编码的HLA蛋白结合时的肽段浓度，单位为nM，一般≤500nM；Rank（%），亲和力相对百分排位，≤2%）。
今天这篇文章我们不说新抗原，直接说通过HLA的基因分型便可以预测免疫治疗的效果及预后，也就是HLA也可以单独作为一个Biomarker来预测免疫治疗的效果，而不需要预测新生抗原与HLA的亲和力。
下面我们看看HLA与免疫治疗之间到底有什么关系：
一、HLA等位基因的抗原呈递能力可能天生就有差别：
MSKCC的研究人员对1535名接受免疫检查点抑制剂治疗的晚期癌症患者HLA-I 基因型进行了研究。研究人员将受ICB治疗的癌症患者分成了两组，第1组为接受CTLA-4抗体或PD-1抗体治疗的369例晚期黑色素瘤或晚期非小细胞肺癌患者，第2组为接受CTLA-4抗体、PD-1或PD-L1抗体单药治疗或联合治疗的1166例泛癌种患者，其中包括黑色素瘤和非小细胞肺癌。
研究结果显示，与纯合子的患者相比，在HLA-I 位点（A/B/C）高度杂合可提高ICB治疗后的总体生存率（一个个体理论上可以产生6种不同的HLA-I（HLA-A/B/C），因为人是二倍体，一条来自父亲，一条来自母亲，所以就是3X2=6个点；如果再加DQ/DP两个基因，那么就是5X2=10个点）。
在两组独立的黑素瘤患者中，HLA-B44超型等位基因的患者延长了总生存期（HLA-B44超型的等位基因很可能本身具有强的抗原呈递能力，从而更容易在免疫治疗中获益），而HLA-B62超型等位基因（包含HLA-B*15:01）或HLA-I的体细胞杂合性缺失（somatic LOH）患者预后差。HLA-B*15:01分子动力学模拟揭示了可能损伤新抗原CD8+T细胞识别的独特元素。
这些超型结合受到HLA-I等位基因特定成分的影响：HLA-B44受到HLA-B*18:01，HLA-B*44:02，HLA-B*44C:03，HLA-B*44:05和HLA-B*50:01的影响；HLA-B62主要由HLA-B*15:01驱动。
值得注意的是，HLA-B44等位基因与癌症基因组图谱（TCGA）中黑色素瘤患者的生存没有关系，这表明HLA-B44的存在是对ICB的预测反应，并不是预后。
研究人员还发现， 单一位点HLA-I基因（A/B/C）纯合性与生存率降低的有显著关联：HLA-A (P = 0.003,HR = 1.38,95% CI 1.11 - 1.70)，HLA-B (P = 0.052,HR = 1.66,95% CI 0.93 - 2.94)，HLA-C (P = 0.004,HR = 1.60,95% CI 1.16 - 2.21)。
二、HLA体细胞突变与免疫逃逸之间的关系
加州大学圣地亚哥分校Joan Font-Burgada教授团队分析了TCGA中10种肿瘤类型共9176个肿瘤患者的体细胞突变与HLA的关系。
作者巧妙的设计了Patient Harmonic Best Rank （PHBR）参数将各体细胞突变产生的长度为8~11突变肽段与3种HLA-I型等位基因（至多共6个HLA-A/B/C）的多个亲和力合并为患者HLA对该突变的整体抗原呈递水平。突变对应的PHBR越高（HLA与突变肽的亲和力越弱），说明患者的HLA对该突变抗原呈递能力越差。
TCGA肿瘤患者中的群体突变频率越高，则该突变所产生的突变肽被HLA抗原呈递能力越弱。可能原因为：肿瘤进化的过程中，携带被HLA高抗原呈递的突变肿瘤克隆在早期免疫监视中已经被免疫细胞识别杀伤而大量清除掉。只有那些携带被HLA抗原呈递弱的突变肿瘤克隆才能更容易逃脱机体的免疫监视，从而在肿瘤形成后表现出高的群体突变频率。
此外，在10种研究的肿瘤类型中，携带了HLA体细胞突变的患者相比HLA野生型的患者有着显著高的TMB。这可能意味着HLA识别新生抗原介导的免疫监视功能的削弱，使得携带突变的肿瘤克隆易于免疫逃逸，在宏观上表现出高TMB。（HLA体细胞变异可能不会获益于免疫治疗）
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