肺部真菌感染的生物标志物
肺部真菌感染的生物标志物重症行者翻译组 何蔼婷=
综述目的
肺部真菌感染（即侵袭性肺曲霉病和毛曲霉病）在中性粒细胞减少或非中性粒细胞减少的患者中的发生率正在增加，是导致患者死亡的主要原因。因此早期诊断并治疗至关重要。生物标志物在此中的作用，是本综述的目的。
最新进展
支气管肺泡灌洗的半乳甘露聚糖在诊断IPA中有最好的识别能力。其基础水平有助于预测预后，其动态变化有助于评估抗真菌治疗的效果。最近PCR技术的标准化为IPA和毛霉菌病的诊断带来的一些改进。目前正在研究的几种新的生物标志物和目前现有的比起来并没有更好的价值。为了提高诊断的准确性，提出了包括半乳甘露聚糖在内的生物标志物进行联合检测。
摘要
生物标志物在肺真菌感染的早期诊断，评估预后和治疗反应性中起重要作用，但需要更多的研究来确定最佳的临床使用方案。
好文推荐：
致病性真菌与条件致病性真菌的区别？主要致病性下呼吸道真菌种类（表）
血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第六次修订版）（2020）
简介
本篇综述探讨生物标志物以曲霉的呼吸道感染为重点，并介绍最新进展。真菌感染在没有接受传统免疫抑制治疗人群中的发生率逐渐上升，其诊断困难且具有挑战性，并且预后不良。影像学仅仅能够提示真菌性肺部感染，而传统的微生物培养作用有限，因此利用其他手段进行临床诊断乃至致病菌的判断至关重要。
生物标志物在诊断中的作用
侵袭性肺曲霉病在非中性粒细胞减少的特别是没有明显危险因素的患者中，由于体征和症状的不典型，常常与细菌性肺炎难以鉴别。早期诊断及治疗对最大限度提高疗效至关重要。对于免疫功能正常的患者也要保持高度的警惕。
IPA诊断金标准是真菌入侵的组织病理证据。但在ICU中，存在肺活检的各种禁忌症（例如凝血功能障碍和/或急性呼吸窘迫综合征），活检的可能性很低。
ICU医生必须鉴别呼吸道中培养出的曲霉菌是定植还是IPA。此外，影像学检查只能提示是否真菌感染。因此，目前认为利用非传统培养的方法，例如生物标志物和分子诊断，PCR等能够提高IPA早期特异性诊断的水平。
半乳甘露聚糖
半乳甘露聚糖是在真菌侵入组织过程中释放出来的位于细胞壁上的一种多糖，是最常用的IPA生物标志物，可以通过针对半乳甘露聚糖的大鼠单克隆抗体EBA-2双夹心ELISA检测。其结果用光密度指数比值来表示，阳性的Cut-off值为0.5。除了血清外，在支气管肺泡灌洗液（BAL）和脑脊液中也具有诊断价值，但在这些标本中，可能cut-off值会更高。尽管该检查能够用于诊断侵袭性曲霉病，但该试验在组织胞浆菌病中可能也为阳性。相反，毛霉菌病中，半乳甘露聚糖水平较低。
在两项荟萃分析报告中，血液科中性粒细胞减少患者中，血清半乳甘露聚糖诊断侵袭性真菌病的敏感性为60-80%，特异性为80-95%。如果两次检测均为阳性，其诊断的准确率将会提高，并且可能会在出现临床症状或影像学改变前表现出来。但在非中性粒细胞减少的患者中，因为循环中的中性粒细胞可以清除抗原，所以诊断价值很小。
抗真菌治疗和中性粒细胞计数对BAL的影响比血清小，所以在BAL中，半乳甘露聚糖有更高的敏感性（85-90%）和特异性（90-95%）。用于诊断IPA的BAL最佳cut-off值仍存在争论。根据之前的研究，最佳cut-off值会根据不同的基础疾病而波动在0.5-1.25之间，荟萃分析建议将1.0作为最佳cut-off值。在非中性粒细胞减少的患者中，0.76有高灵敏度（100%）和阴性预测值（96.2%）。最近的另一项研究也证明了这一点，其研究出的IPA诊断的最佳cut-off值为0.7。
因为黄曲霉的BAL半乳甘露聚糖的敏感性低于烟曲霉，所以烟曲霉的BAL半乳甘露聚糖指数（GMI）高于黄曲霉感染患者。这证明使用不同的cut-off值是合理的。
将BAL半乳甘露聚糖作为AspICU临床算法的附加标准，可以提高ICU患者IPA诊断的敏感性。
最近，尿半乳甘露聚糖测试以进入研究。血清和尿液半乳甘露聚糖水平之间呈正相关。通过计算尿液中半乳甘露聚糖/肌酐的比值能够提高准确性，cut-off值为0.26时具有良好的阴性预测值（大于98%），是排除高危患者侵袭性真菌感染的一个良好手段。
表1总结了半乳甘露聚糖假阳性和假阴性结果的原因。
葡聚糖
1.3-β-d-葡聚糖（BDG）是除毛霉菌和隐球菌外大多致病真菌细胞壁的主要成分。根据多项荟萃分析，其血清浓度对侵袭性真菌感染的诊断有良好的敏感性（60-80%）和特异性（80-90%）。由于非中性粒细胞减少患者的相关数据有限，对这了患者的特异性和敏感性仍存在疑问。此外，很少有研究评估BDG在BAL中的作用。和半乳甘露聚糖一样，已经报道了几种BDG假阳性和假阴性的结果。
还建议将BDG作为对布氏肺孢子虫肺炎（PJP）的一种侵袭性较小的诊断。它对PJP的诊断有非常高的准确性（95%的敏感性和86%特异性），表明阴性结果能够排除诊断，而BDG阳性可以作为诊断PJP的有力指标。最近，Son等人的报道显示，PJP患者的血清BDG水平和念珠菌血症的患者相似，但显著高于IPA，毛霉菌及肺结核患者。而为了提高其排除PJP的能力，目前建议降低血清cut-off值的方法。
PCR
现在已经开发出了针对各种遗传序列的PCR测定法用于诊断曲霉菌感染。
在最近的一项荟萃分析中，全血和血清的PCR分析的综合诊断能力处于中等水平（敏感性和特异性分别为84%和76%），表明阳性或阴性结果都无法单独明确或排除可疑感染。值得注意的是，至少两个阳性PCR检测结果能够将特异性提高到95%，但敏感性降低到64%。此外，若使用欧洲曲霉菌PCR倡议的建议来定义PCR阳性，其诊断能力也会提高。因为血浆标本具有最佳的敏感度（91%），建议将血浆标本最为第一步筛选步骤。若血清中的PCR成阳性，则应使用全血作为附加检测，以达到接近100%的阳性预测值。
在BAL中，曲霉菌PCR诊断的真准确性似乎较高（敏感性91%，特异性92%），但也有其他结果报道了较低的敏感性。
针对血清和BAL的与临床相关的毛霉素为靶点的多重PCR检测在毛霉病的早期诊断中显示了良好的结果。
曲霉菌侧流（Aspergillus lateral flow devices）
ALFD是通过JF5单抗检测曲霉特异的胞外甘露糖蛋白的一种免疫色谱分析方法，检测快速且简单，并且只与青霉素存在交叉反应。在最近的荟萃分析中，其在血清（敏感性68%，特异性87%）和BAL（敏感性86%和特异性93%）的诊断能力和半乳甘露聚糖相当。与半乳甘露聚糖一样，在接受抗霉菌治疗的患者，ALFD的敏感性由86%降低到了52%。在ICU的患者中，BAL的ALFD敏感性（79%）和特异性（85%）均较低。
尿抗原
曲霉分泌的某些半乳糖抗原能够被肾脏清除。除曲霉外，可以通过侧流系统在尿液中检测到。但也有报道其与毛霉菌，拟青霉菌和红色毛藓菌成阳性反应。但在一项初步研究中，该诊断具有良好的敏感性（80%）和特异性（92%），并且其准确性似乎不受抗真菌治疗的影响。
铁载体
铁载体是真菌产生的铁捕获分子，可以在细胞内捕获及转运铁。它们是烟曲霉重要的毒力因子，在感染过程中，其水平会明显升高。用质谱法在侵袭性真菌感染患者的BAL和血清中检测三乙酰基镰刀菌素C（TAFC），其灵敏度和特异性分别为40%和79%。目前来看，它似乎为GM实验提供了更多的补充信息。但它仍存在一定的局限性，它并不是所有曲霉的生物标志物（仅烟曲霉和构巢曲霉），并且其他霉菌（锄禾镰刀菌）也能够产生。
尿液中TAFC/肌酐水平（cut-off值为3）似乎对侵袭性曲霉感染有一定诊断价值（敏感性86%，特异性88%），与血清及BAL中GM实验结果相当，但其效用在抗真菌治疗成功的情况下会有所下降。
胶质毒素及代谢产物
胶质毒素是在烟曲霉及其他真菌菌丝生长过程中产生的重要毒力因子，是一种具有免疫抑制作用的次级代谢产物。其在血液中被迅速清除，所以诊断准确性较低。为了克服这个限制，目前研究了一种生物活性较低但更加稳定的代谢产物（双（甲硫基）胶质毒素），得到了相矛盾的结果。
血清双糖质谱法
基质辅助激光解吸附/电离飞行（flight）时间可以检测出IPA和毛霉病患者血清双糖（MS-DS）的质谱。其具有较好的敏感性（93%）但特异性却很低（76%）。由于没有可用的循环生物标志物，MS-DS似乎在对毛曲霉病诊断方面具有一定价值。但该生物标志物是否能够用于常规诊断，需要更多证据佐证。
细胞因子
目前也建议将细胞因子作为IPA的诊断指标。BAL中的IL-8及血清中的IL-10及IL-17均表现出了良好的诊断能力。同时结合肺泡IL-8，IL-6和IL-23可以提高诊断的准确性。
穿透素-3
穿透素-3（PTX3）是一种在炎症反应或损伤部位产生的一种可溶性模式识别受体，在先天免疫中起到重要作用，并且是感染严重程度和预测死亡的指标。在中性粒细胞减少和非中性粒细胞减少的IPA患者中，BAL的PTX3水平明显高于定植患者，因此可作为辅助诊断的有力工具。但是在其他炎症性疾病（例如细菌感染）情况下其也会升高。
生物标志物组合
使用不同的测定方法可以检测不同的真菌靶点从而能够提高诊断的准确性。最近一项包含13项研究的荟萃分析表明，半乳甘露聚糖和BDG阳性结果在诊断IPA方面有较高的价值。半乳甘露聚糖或ALFD（即：BAL）可用于对IPA高风险的患者进行筛查，若两个均为阴性可以排除。
当任一结果确定是阳性时，将BAL-半乳甘露聚糖与血清半乳甘露聚糖或BAL-PCR联合检测可增加IPA诊断的敏感性。
当与BAL TAFC联合使用，BAL半乳甘露聚糖的敏感性和特异性也会增加。PTX3可以用于区分BAL半乳甘露聚糖假阳性的结果。在一项小型研究中，血清及BAL PTX水平和BAL半乳甘露聚糖联合检测能够诊断所有IPA病例。
半乳甘露聚糖，PCT或新型生物标志物（例如TAFC）与血清或BAL中的ALFD联合检测，对血液系统疾病患者具有更高的准确性。
结论
目前没有可用的单一的生物标志物在诊断真菌性肺部感染上有足够的敏感性和特异性。在中性粒细胞减少和非中性粒细胞减少的患者中，BAL中的半乳甘露聚糖似乎具有最佳的诊断准确性。尽管目前存在争议，但非中性粒细胞减少患者BAL半乳甘露聚糖的最佳cut-off值为0.7。
真菌PCR技术的标准化为侵袭性真菌感染（例如IPA或毛曲霉病）的诊断带来新的理念。ALFD在多项临床研究中显示出了较高的诊断性能，但在ICU患者中的准确性似乎较低。
现在正在研究新型生物标志物，但由于他们的鉴别诊断能力并不比目前的生物标志物高，因此，在将其常规应用于临床之前，需要进行大量研究评估其准确性。
最佳的诊断方法应该是进行联合检测。一些研究表明，BAL中的半乳甘露聚糖联合其他非培养性诊断（例如：BDG，ALFD或PCR）方法能够显著提高诊断的准确性。
半乳甘露聚糖用于评估治疗反应和评估预后
判断侵袭性曲霉病的治疗反应性是比较困难的，尤其是对于中性粒细胞减少的患者，使用免疫调节药物或宿主免疫功能受损的情况下。除了作为诊断工具，半乳甘露聚糖的测定可能在监测治疗反应性和评估预后方面有一定作用。
半乳甘露聚糖基础水平对预后的影响
由于血清半乳甘露聚糖水平和真菌负荷量相关，血清甘露聚糖水平与42天和180天的短期和长期生存率存在较强且一致的相关性。基础半乳甘露聚糖水平高于0.5的患者死亡率明显高于低于0.5的患者。Dabas等研究根据AspICU的方法，对死亡率最佳的预测cut-off值为1.24。
另一项研究还报道了BAL半乳甘露聚糖和第六周生存率之间存在显著关系，但由于其他研究并没有得出类似结果，所以需要谨慎对待该研究结果。
半乳甘露聚糖动态水平监测治疗反应
与半乳甘露聚糖的基础水平一样，基础水平后的动态变化与预后似乎存在显著相关性。评估血清半乳甘露聚糖从其基础水平下降的速率发现，这是判断预后的良好指标。此外，在抗真菌治疗的6周后，半乳甘露聚糖水平回落到正常或0.5以下，提示了良好的治疗反应性及生存率。相反，若血清半乳甘露聚糖水平升高，与死亡高风险存在独立的相关性。
甚至，可以通过在抗真菌治疗的前两周监测其变化趋势来预测临床预后，因此早期的血清半乳甘露聚糖的变化趋势似乎也可以预测侵袭性曲霉病的预后。治疗12周后对治疗有反应的患者在治疗第一周时的半乳甘露聚糖水平明显低于治疗无反应的患者。尤其是较基线水平下降超过35%可以预测临床治疗有效。Chai等人的结果显示，对于半乳甘露聚糖小于0.5的侵袭性曲霉病患者，在治疗前两周，半乳甘露聚糖水平每增加0.1u，临床效果不满意的可能性增加21.6%。Neofytos等的研究也证实了这一结果，侵袭性曲霉病的患者治疗前2周生物标志物（半乳甘露聚糖和BDG）的降低和6周生存率有关。半乳甘露聚糖基线水平和/或持续阴性提示存在治疗反应并且有较高的存活率。
结论
这些研究结果表明，生物标志物即半乳甘露聚糖的变化可能有助于预测或评估侵袭性曲霉病患者的治疗反应和预后评估。虽然在非中性粒细胞减少患者中的敏感性较低，但对实体器官移植患者和预防性抗真菌治疗的患者没有影响。需要进一步的研究确定临床相关的cut-off值，然后在血液系统疾病和非血液系统疾病的患者中进行验证。此外，其他的几种生物标志物，例如BDG和曲霉DNA或RNA可能在诊断中会提供一些信息，但仍缺乏足够的证据。
好文推荐：
点击阅读原文，进入临床技能专辑。