复旦大学附属中山医院胡必杰解读宏基因组二代测序

胡必杰解读宏基因组二代测序

来源于医学界呼吸频道 胡必杰、赵佳宾 

相关数据显示，呼吸系统感染是造成全球死亡人数最多的一类感染。呼吸系统感染的病原体种类繁多，病原诊断困难，虽然近年来分子生物学方法在感染性疾病病原检测中表现突出，但仍有50%左右的呼吸系统感染无法明确病原体。

宏基因组二代测序（mNGS）通过对临床标本进行宏基因组测序，可以无偏向性地检出标本中的各种微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫），目前已被广泛应用于临床感染性疾病的病原检测，越来越多的临床研究及特殊病原体感染案例报道（特别是少见、苛养病原体）肯定了mNGS在感染性疾病病原体诊断中的重要价值。

为进一步促进我国呼吸与危重症医学科的学术发展，由上海市公共卫生临床中心呼吸与重症医学科主办的全国《传染病危重症诊治学习班》暨《上海公卫呼吸重症论坛》于2022年8月5日～6日在上海隆重举办。会议上，复旦大学附属中山医院胡必杰教授分享《呼吸系统感染中mNGS临床应用与结果解读专家共识》的要点，让我们跟着胡必杰教授一起学习吧～

胡必杰译著

呼吸系统感染mNGS送检

和结果解读的特殊性

胡必杰教授列举中枢神经系统感染，通常脑脊液、血培养2个标本对比即可判断病原菌。但是呼吸系统是非无菌部位，与外界相通，微生物组成尤为复杂，存在定植菌与感染菌鉴别的困难。

其次，样本类型的多样性[主要包括：肺泡灌洗液、痰（咳痰、雾化导痰、经人工气道吸痰）、肺组织活检、鼻咽或口咽拭子、胸腔积液、纵隔/肺门淋巴结、外周血、福尔马林固定石蜡切片]，不同的呼吸系统感染类型优选的标本类型也不同，不同的标本类型检测结果解读原则也不尽相同。然而，适用于送检mNGS的适应证究竟有哪些？为此专家共识也给出具体推荐，为临床提供参考。

呼吸系统感染临床送检适应证

▎推荐1：疑似下呼吸道感染（LRTIs）的危重症患者，建议送检mNGS。

由于现有常规微生物检测方法敏感度低、检测时间长及病原谱窄等因素的限制，LRTIs病原检出率低。重症LRTIs患者若得不到及时有效治疗，病情可迅速进展，甚至危及生命。重症肺炎中mNGS较传统方法病原检出率更高，可降低重症肺炎病死率。

▎推荐2：免疫功能抑制患者的呼吸系统感染，建议送检mNGS。

免疫抑制患者发生呼吸系统感染时，致病病原体较免疫正常患者更为复杂，且起病隐匿，进展快速，预后差，病死率高，故应特别重视，尽早明确病原学诊断。

免疫抑制按机制主要分为粒细胞减少或功能障碍、体液免疫缺陷和细胞免疫缺陷三种类型，某些患者可能存在联合免疫抑制。在免疫抑制患者中，mNGS检测到的病原体更多，临床符合率高，能发现更多的真菌、病毒以及混合感染，如巨细胞病毒（CMV）合并耶氏肺孢子菌。

▎推荐3：疑似慢性肺部感染或难治性感染，且既往治疗效果不佳时，建议送检mNGS。

普通医疗机构对于慢性感染病原体及特殊病原体缺乏有效的检测手段。通常这类病原体检测耗时长、敏感度低或完全无法通过常规的培养及免疫学手段进行确诊。

多个临床研究显示，mNGS在分枝杆菌（结核分枝杆菌MTB、非结核分枝杆菌NTM）、真菌（毛霉、曲霉）和厌氧菌等病原体检出优于传统培养。

▎推荐4：疑似呼吸系统感染暴发且病原体不明，建议送检mNGS。

呼吸道感染暴发应采取准确、快速、全面的方法以尽快明确病原体，医院感染管理科、疾病预防控制中心等部门方可根据病原体采取有效的防控措施。对于新发病原体，mNGS具有传统培养及靶向分子诊断技术所不具备的优势。

▎推荐5：通过有创性操作获取的组织标本，如经皮肺穿刺组织、经支气管镜肺活检组织（TBLB）及经超声支气管镜淋巴结穿刺活检组织（EBUS-TBNA）等，建议送检mNGS。

经皮肺穿刺活检术、TBLB、EBUS-TBNA需在CT、Ｘ线透视或超声引导下进行，能够直接取到病变组织。但是，标本采集操作难度高、标本重复采集可能性低，目前包括组织病理、肺组织涂片、培养及其他分子生物学检查均有各自的局限性。

因此，送检mNGS可提高病原诊断敏感度，通过不同检测方法组合，提高病原诊断率，尽早进行目标性治疗。

▎推荐6：怀疑厌氧菌引起的肺脓肿、坏死性肺炎或其他肺部感染，建议采集避免口腔菌群污染的标本（如下呼吸道标本、经皮穿刺肺活检组织及胸腔积液），送检mNGS。

厌氧菌培养需要绝对厌氧环境，且通常为合并感染，故常规培养阳性率低，由混合口腔厌氧菌所致慢性肺脓肿并不少见。多项研究发现，mNGS在厌氧菌诊断中具有优势，通过mNGS证实了如以微小单胞菌、具核梭杆菌等为主的混合厌氧菌感染病例。

值得注意的是，以上送检的“推荐”，建议在送检mNGS的同时送检传统微生物检测。

呼吸系统感染送检标本类型选择

呼吸道感染标本类型的选择首先需考虑从原发感染部位采集，下呼吸系统感染更为复杂，肺部病灶部位、形态、大小、咳痰质量、有创操作耐受情况等均会影响选取最合适的标本类型。

▎推荐7：怀疑感染的肺部弥漫性病变，目前建议首选支气管肺泡灌洗液（BALF）；若无法耐受有创性检查，建议选择诱导痰、咳痰或者经上呼吸道吸痰标本。

对于LRTIs，最常见送检标本是BALF和痰。BALF直接取自下呼吸道，相较于痰标本黏稠、不均匀以及易被口咽部定植菌影响的短板，BALF直接取自下呼吸道，更推荐其作为LRTIs的首选标本。

然而，收集BALF需进行有创的支气管镜检查，需考虑患者耐受情况，咳痰、诱导痰或经上呼吸道吸痰标本可作为一种替代标本。虽然没有mNGS在同一患者的BALF与痰标本检出阳性率及临床符合率的研究，多个研究结果也证实了BALF在检出各种病原体中的优势。

▎推荐8：怀疑病毒性LRTIs者，建议同时送检下呼吸道标本进行DNA＋RNA检测。

病毒性肺炎的常见呼吸道病原体可分为RNA病毒及DNA病毒，以RNA病毒为主。常见的RNA病毒包括流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒和肠道病毒（如柯萨奇病毒、埃可病毒）等，DNA病毒常见腺病毒、CMV、单纯疱疹病毒等。

行DNA和RNA检测所需标本保存条件有所区别，RNA容易降解，对标本的采集、保存和运输条件相对苛刻。当不能排除RNA病毒感染时，应考虑行RNA流程检测。DNA＋RNA检测流程可保证对包括RNA病毒在内的全部微生物类别进行检测覆盖。

胡必杰教授指出RNA病毒常为“漏网之鱼”。导致急性呼吸道感染的常见病毒中，RNA病毒的比例高。同时有研究显示，中国成人和青少年社区获得性肺炎（CAP）中病毒性肺炎达27.5%，因此需加强对RNA病毒的重视。

▎推荐9：疑似病毒性LRTIs者，若无法获得下呼吸道标本，建议采集鼻咽拭子或外周血送检mNGS。

病毒性肺炎通常无明显咳痰，只有28％～33.7％的新型冠状病毒肺炎患者可以采集到痰标本。而鼻咽拭子在流感、新型冠状病毒肺炎中被证明具有很好的诊断价值。

另有研究发现，血液标本在部分病毒的鉴定上优于BALF。外周血检测作为一项无创、简单及快速的检测方式，相对于BALF、肺组织活检等有创检查方法极具优势。所以如果无法获得下呼吸道标本，可以考虑采取上呼吸道标本或者外周血标本进行检测。

▎推荐10：对于肺部外周性病灶、局限性病灶或纵膈、纵膈／肺门淋巴结肿大，应根据病灶的特点，个体化选择有创性操作方式获取组织送检。

如果传统微生物检测方法阴性，经验性抗感染效果欠佳的局限性病灶、外周型结节团块病灶或纵膈／肺门淋巴结肿大，建议行有创性检查。需有经验的临床医师综合考虑，根据病灶大小、位置、与支气管位置、周围血管分布以及操作者对采样技术的熟练程度，分析操作的可行性和评估可能不良反应，选择更适合、活检成功把握度高的方法，如超声、CT或导航直视下操作可直达病变部位，精确取材可显著提高mNGS的检出阳性率。

肺组织标本较BALF人源背景序列高，虽然目前无相关研究比较同一部位BALF和肺组织mNGS结果，既往的研究结果和经验显示，对于多种病原体，BALF较肺组织敏感度更高。以适当技术进行人源核酸去除可有效提高整体检测敏感度。同时建议新鲜组织行mNGS，虽然目前也有福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本行mNGS，但由于实验流程复杂，对DNA和RNA易造成损害。虽然FFPE可长期保存，但却很难被有效地处理和分析，另外易被如真菌、NTM及细菌等环境微生物污染。

▎推荐11：对于疑似肺部感染而无法取得呼吸道标本患者，建议采集外周血送检mNGS。

除了呼吸道感染继发血流感染的情况外，肺部病原凋亡后的细胞游离DNA依然可能释放到外周血中被检测到。当前对于外周血mNGS检测提示呼吸道感染责任病原的可行性缺乏大规模临床研究的支持，但是一些研究结果提示其可行性。在这类小规模研究中，对于呼吸道感染的患者，外周血中病原检测阳性率为35%～86.7%，造血干细胞移植患者疑似侵袭性曲霉感染患者中外周血mNGS检测的敏感度为51%，对于非曲霉侵袭性真菌感染的敏感度达79%。

▎推荐12：对于肺部病灶疑似为全身疾病累及的患者，建议采集其他局部病灶作为次选标本，送检mNGS。

某些病原体可导致全身多部位感染，如分枝杆菌、隐球菌、诺卡菌等，肺部病灶作为全身感染的一个部分，若临床上考虑一元论的可能性大，但又无法明确诊断时，可根据获得标本的难易程度及诊断价值，取多个病灶行mNGS检测，检测结果符合临床特征及胸部影像，可作为辅助诊断肺部病灶的依据。

呼吸系统感染中

mNGS结果解读原则

1.结合临床、实验室检查、胸部影像学；

2.结合其他传统微生物报告、交叉验证；

3.结合微生物的种类，判定是定植菌、感染菌，还是背景菌（环境中污染，试剂不能去除的核酸片段问题）；

4.结合检出相对丰度、序列数；

5.若有条件，可结合多个不同样本类型。

不同类型标本宏基因组二代测序

检出微生物的临床意义

表1-2不同类型标本宏基因组二代测序检出微生物的临床意义

▎推荐13：若痰标本或BALF检出上呼吸道常见定植微生物，如草绿色链球菌、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、普雷沃菌属、韦荣球菌属、罗氏菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属、念珠菌属等，考虑定植可能大。

某些病原体可导致全身多部位感染，如分枝杆菌、隐球菌、诺卡菌等，肺部病灶作为全身感染的一个部分，若临床上考虑一元论的可能性大，但又无法明确诊断时，可根据获得标本的难易程度及诊断价值，取多个病灶行mNGS检测，检测结果符合临床特征及胸部影像，可作为辅助诊断肺部病灶的依据。

▎推荐14：若痰标本或BALF检出不存在或很少存在于口腔的病原体，如嗜肺军团菌、衣原体、百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌等，考虑致病微生物可能大。

常见呼吸道确定的致病病原体如结核分枝杆菌（MTB）、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、百日咳博德特氏菌、军团菌属、耶氏肺孢子菌、诺卡菌属、组织胞浆菌、球孢子菌属、隐球菌属、皮炎芽生菌及病毒等，此类病原体一旦检出即使序列数少仍需考虑致病微生物可能大。

另有一些少见的呼吸道确定病原体如土拉弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、贝纳柯克斯体、鹦鹉衣原体、布鲁菌、沙门氏菌属、多杀巴斯德菌、水痘带状疱疹病毒、寄生虫。但仍需注意某些环境和水源性微生物，军团菌等致病菌也存在水源污染可能，判读需谨慎。

▎推荐15：若呼吸道标本检出结核分枝杆菌复合群（MTBC，包括MTB、卡内蒂分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛分枝杆菌），即使序列数极少，仍需考虑其为致病微生物的可能。

MTB DNA提取困难，而污染的可能性低，有研究主张在种或属水平上至少有１条特异性序列时被认为是阳性。当mNGS报告中检出序列数较低的MTB时，可要求检测机构对检出特异性序列进行复核，或对原始标本进行其他方法验证以确定检出的真实性。例如送检BALF标本，mNGS报告出１条MTB序列时，也应高度重视：一方面可要求报告出具方回溯检测流程和质控，对原始标本进行聚合酶链式反应（PCR）验证；另一方面可加做X-pertMTB／RIP等MTB特异性检测方式进行确认。MTBC中４种分枝杆菌的基因组序列具有很高的相似性，因此建议关注MTBC特异性序列数，而不是某单一物种的特异性序列。

Miao等将MTB特异性序列数（属或种水平）在细菌列表中排名前20位时被定义为阳性。因此，MTB在检出至少１条特异性序列时，即有可能提示感染，建议结合临床证据来解读，如是否有影像学证据支持。

▎推荐16：若呼吸道标本检出非结核分枝杆菌（NTM），需结合所检出分枝杆菌属排名情况及种的类别，如常见致病的鸟胞分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌，考虑其为致病微生物的可能。

由于医院实验室环境污染和低产出率的平衡，有研究认为NTM的特异性序列数（属或种水平）在细菌列表前10位时被定义为阳性。临床经验建议NTM检出10条以上特异性序列时，考虑感染可能性较大，仅有极少量检出序列时存在标本污染或定植的可能性。

▎推荐17：若呼吸道标本检出隐球菌属、曲霉属、毛霉属及其他丝状真菌，若检出序列数较低，需结合影像学、血清学、组织病理学等考虑其为致病微生物的可能。

真菌（主要包括曲霉属、毛霉属、隐球菌属与双相真菌等）通常基因组较大，并且存在较厚的细胞壁，同样存在核酸提取效率低的情况。即使前期进行了破壁处理，其检出的特异序列数相对其他微生物仍然较少。因此对于真菌的鉴定，有研究认为，mNGS检出真菌（种水平）的特异性序列数是任何其余真菌的５倍以上，判断为阳性。由于不同检验机构mNGS流程、方法存在差异，检出结果有一定误差。

对于上述检出较为困难的微生物，除了结合临床证据，建议和其他微生物检出技术交叉验证，如特异引物的PCR等分子生物学检测、ＧＭ试验等血清学试验等，进一步确认或排除病原微生物。如果临床有疑似难检出的病原体感染，在报告中未列举，建议追溯原始数据进行复核，在报告阈值之外考虑可能的原始检出病原体。

▎推荐18：医院获得性肺炎／呼吸机相关肺炎（HAP/VAP）患者若检出院内感染病原体，如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌及嗜麦芽窄食单胞菌等条件致病菌，需要将检出序列数、相对丰度与机械通气、临床信息、影像学证据综合考虑是否为致病微生物。

对HAP/VAP患者进行mNGS，主要集中三个方面进行结果的判读：

（１）如果某种病原体较其他病原体相对丰度有较大（数量级）优势，可能会是责任病原体。HAP/VAP患者气道和（或）人工气道易有不动杆菌属、假单胞菌属、嗜麦芽窄食单胞菌等定植，即使检出有较大丰度优势，仍需结合临床特点及影像学表现考虑是否为致病原。

（２）如果检出相对丰度低，且患者无相关的临床表现，该检出是定植或污染的可能性大。

（３）若在同时送检的呼吸道标本和外周血标本中检测到相同的病原，判断是致病原的可能性大。

为此，胡必杰教授通过一个案例让大家更好地理解，当痰mNGS报告检出鲍曼不动杆菌（AB）和鹦鹉热衣原体等病原体少量核酸序列，需要考虑鲍曼不动杆菌是否为插管后定植菌，金黄色葡萄球菌、棒状杆菌是否可能为呼吸道定植菌，鹦鹉热衣原体才是致病菌呢？

后续的临床治疗过程中，也确实得到了验证。该患者加用多西环素治疗后，病情迅速好转。还值得注意的是，对治疗鹦鹉热衣原体感染时，喹诺酮类药物其疗效低于四环素类药物。

表3

（下面的图，清晰度高些）

 图1

▎推荐19：免疫功能抑制患者的呼吸系统感染检出的低毒力病原体，需考虑致病微生物可能大。

呼吸道定植病原体在免疫低下或呼吸道屏障功能破坏时，可能会由定植转为致病，如金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、念珠菌属或部分病毒等。深部痰标本或BALF检出以上病原体，也需要重点关注并综合患者的临床表现和其他病原学检测手段综合判定。

常见呼吸道感染病原体仍是免疫缺陷患者最常见的致病菌，在免疫缺陷患者和有基础性疾病患者呼吸道中检测到真菌如耶氏肺孢子菌、曲霉、隐球菌、马尔尼菲篮状菌等，DNA病毒如腺病毒、CMV及EB病毒等，RNA病毒中鼻病毒等，序列数及相对丰度较低时，仍需考虑为致病菌。

图2 貌似背景菌的致病菌

 图3

▎推荐20：mNGS如检出高传染性或高致病性病原体，无论特异性序列数多少都应充分重视，需对检测结果进行复核以及使用其他检测技术验证。

强／烈性传染病病原体，指《中华人民共和国传染病防治法》中规定的甲类和乙类传染病病原体，大部分病毒为高传染性病原，符合《人间传染的病原微生物目录》中的第一类和第二类规定。如送检mNGS报告出高传染性疾病病原体，应根据当地卫生行政部门制定的报告程序上报，同时做好相应的防范隔离措施。对于人畜共患高致病性和高传染性病原体，如狂犬病病毒、布鲁菌及人感染高致病性禽流感病毒等，如有检出，除复核，并上报地方疾病预防控制中心进行验证，若确证试验阳性，按传染病要求上报系统。

▎推荐21：呼吸道标本若检出环境中广泛存在的微生物时，需考虑标本处理过程中的污染。

采样、检测过程可能受环境广泛存在微生物的影响，尤其对于这类病原体检出序列数及相对丰度较低时，污染来源可能性相对更大，需结合临床其他检测手段及患者临床表现来判断此病原体为责任病原体的可能性。

如NTM中的很多菌种广泛存在于自然界中，当mNGS检出病原体种类较多，其中少见致病的NTM（如耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾分支杆菌等）相对丰度及序列数相对较低，则需考虑环境污染可能。

此外，军团菌、曲霉属及阿米巴等，也都广泛存在于自然界中的水、土壤和空气中，军团菌主要在人工水环境中居多，嗜肺军团菌是引起军团菌病的重要的菌种。曲霉属的烟曲霉、黄曲霉及黑曲霉为主要致病菌。因此当有低序列数的非嗜肺军团菌和其他曲霉菌等检出时，最终都需要结合相关临床表现、影像学进行判读，同时有必要采用其他方法进行验证确诊。

▎推荐22：呼吸系统标本若检出大量口腔厌氧菌，需结合患者的病史、标本类型，必要时结合文献资料综合判读。

对于肺脓肿、坏死性肺炎患者，需考虑经由咽、口、鼻腔等途径吸入病原体。厌氧菌占肺脓肿病因的60%～80%，如具核梭杆菌、星状链球菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃菌、微小单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌及齿垢密螺旋体等，痰标本或BALF检出大量口腔厌氧菌，需结合病史、肺部影像学考虑是否为致病微生物，必要时进行其他类型标本验证；若经皮穿刺肺组织检出大量口腔厌氧菌，需考虑为致病病原体。

▎推荐23：若2种类型呼吸道标本或1种呼吸道标本与1种非呼吸道标本同时检出同一病原体，需考虑有临床意义。

临床应用中，常有同一患者多种类型标本同时检测的情况，如BALF与外周血，多标本检测为致病菌判断提供了更多参考信息，尤其对于呼吸道这类存在多种定植菌的标本鉴别价值大，若有一致检出，则需重点关注，不一致时需要结合其他因素综合分析。

胡必杰教授提出虽然mNGS技术对于传统病原学检测技术具有优势，但是仍然具有自身的局限性，其检测结果不宜作为唯一的临床感染性疾病诊断依据。检测结果的临床意义也需要结合患者的病史、用药史、免疫状态等进行综合分析。传统病原学检测技术依然是临床感染性疾病诊断的有效信息手段，也应得到充分合理的应用。各类检测相互交叉印证，可以获得更为准确可靠的病原学信息。

最后，胡必杰教授强调随着mNGS技术在现阶段临床的应用，由于mNGS的无偏向性，易造成假阳性问题，为避免新一轮抗菌药物滥用，应规范报告解读。

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