【LorMe课堂】不可培养微生物真的不可培养？—铁载体说可以
作者介绍：王伟，南京农业大学博士在读，主要研究人工合成菌群。
创新没有捷径，如果有，那就是阅读高质量文献。LorMe课堂主要展示研究生课程文献研讨环节的作业！本期LorMe课堂为您介绍以铁载体获取微生物的新策略。
大多数细菌物种不能在合成培养基上生长。许多不可培养的微生物需要来自其他细菌的生长因子才可以生长，但这些化合物的性质在很大程度上是未知的。本文发现：从海洋沉积物生物膜分离且最初不能在培养皿中生长的微生物，在来自相同生境的微生物存在的情况下，不能生长的微生物又可以在培养皿上生长。一类由辅助菌株产生的生长因子被鉴定为新的酰基-去铁胺类铁载体。一组先前不能单独培养的微生物表现出：在一种新的铁载体存在情况下能够生长的现象。这种基于铁载体的方法只能够培养与可培养微生物亲缘性远的不可培养微生物。来自该生境的许多菌株在实验室中无法生长原因是无法自主生产铁载体，来自其他微生物产生的代谢产物调节了环境中微生物群的建立。
将沉积物与海水分离并在无菌盐水中涡旋，分散覆盖沙粒的生物膜(Figure 1)。将含有细菌细胞的液体连续稀释并涂布在含有50％无菌海水（R2Asea）的营养培养基上。在30℃培养5天后，在平板上出现不同形态的菌落(Figure 2A)。作者假设在密集接种的平板上生长的一些细胞正在接收来自邻近菌落的生长因子，并且不会孤立地生长。为了测试微生物对邻近物种的可能的生长依赖性，从高密度板（每板50-200个菌落）中挑选彼此相距2cm距离内生长的菌落对，并且彼此非常接近地重新划线。将两个分离的微生物中的每一个在R2Asea板上划线并穿过板的中心交叉划线，产生近端，远端和重叠接种区域(Figure 2B)。潜在的不可培养的微生物通过它们随着与交叉条纹平板上培养的“辅助”菌株的距离增加而减少的生长来鉴定。
图1 Intertidal Sand Grains。(A)洗过的海水中砂粒的照片。比例尺，3毫米。(B)单个砂粒的电子扫描显微镜(SEM)照片。比例尺，50μm。(C)图像B中的黑框区域更高分辨率的SEM照片。比例尺，10μm。(D)生物膜的SEM照片，其可以看到附着在沙粒表面上，其代表在本研究中通过涡旋分离重悬浮的细菌细胞的来源。比例尺，10μm。(E)附着在砂粒表面上的各个细菌的SEM图像。比例尺，3μm.
图2 M. luteus KLE1011对 M. polysi-phoniae KLE1104 生长的诱导。将细菌细胞从沙的生物膜中重悬浮并涂板子，以分离依赖于邻近菌落的物种。(A)从沙粒中分离细菌的细菌。(B)环境辅助M. luteus KLE1011交叉划线(板的右侧)与未培养的分离物M.polysiphoniae KLE1104(板的左侧)。当更接近辅助细胞时，未培养菌株的菌落更大。(C)用M. luteus KLE1011过滤过的上清液诱导的生长M. polysiphoniaeKLE1104。在所有测试的处理中，不可培养的表型，包括KLE1011，保持稳定。
作者推断，如果发现一种由大肠杆菌帮助的不可培养的微生物则可以很容易地鉴定出小分子生长因子。然后测试缺乏合成生长因子能力的大肠杆菌突变体菌株将揭示其生物合成基因。过滤的大肠杆菌的上清液能够诱导几种不可培养的微生物的生长，包括M. polysiphoniae KLE1104(Figure 3A)。从产AI-2缺陷的菌株(ΔluxS)的上清液和由不分泌吲哚的菌株(ΔtnaA)显示出正常的生长诱导(Figures 3B and 3C)。然而，ΔentB 和 ΔentC，无法合成肠菌素的菌株，均不能诱导M. polysiphoniaeKLE1104的生长(Figures 3D and 3E)。将肠菌素点在具有M. polysiphoniae KLE1104 的平板上可以强烈诱导其生长(Figure 3F)。
Figure 3大肠杆菌对 M.polysiphoniae KLE1104 诱导生长能力.E. coli BW25113滤过的上清液可诱导M. polysiphoniaeKLE1104的生长，而E. coli突变株的培养基上清液则不能诱导其生长。(A)从亲上清液的大肠杆菌 BW25113菌株诱导生长，如从缺陷菌株确实上清液，Δ luxS(B)和Δ 的tnaA(C)。在该实验中，tnaA突变体周围有更多的生长，但随后的检查显示这是由于该定性测试的变化。(D和E)缺乏肠杆菌素合成，ΔintB(D)和ΔentC(E)的菌株的上清液不诱导未培养的菌株的生长。即使在KLE1104的高密度下也未观察到生长。(F)将纯化的肠菌素点在与均匀分布的板M. polysiphoniae分离物KLE1104诱导的生长。随着与肠杆菌素来源的距离增加，菌落大小减小，并且在远离来源的情况下未观察到未培养的生长。
因为植物将微生物识别为“异己”，根系微生物群在默认情况下会被植物的免疫系统隔离。因此，有益微生物操纵宿主植物的免疫系统是建立互助有益关系的第一步。Lebeis等发现植物防御相关激素水杨酸在拟南芥根系内部的微生物装配中起重要作用。通过分析根系内生微生物水杨酸的生物合成和信号突变，他们发现水杨酸或水杨酸调节的植物进程调控根系特定微生物群落的定殖，进而给特定的细菌分类进入根系内部微生物群落设定了不同的闸门。这些发现准确地指出了植物基因型特征作为根际微生物群落结构进程的一员，与植物免疫相关。
作者通过固相萃取纯化天然辅助菌株M. luteus KLE1011的培养基上清液代谢物，通过（LH-20）和（C18）反相高效相色谱进一步纯化出五种不同的铁载体(Figure 4A)。又通过LC-MS坚定了物质的结构(Figure 4B)。
Figure4 M. luteus KLE-1011产生的活性铁载体。(A)反相C18 HPLC-MS/UV-可见光谱分析。通过C18 HPLC分离铁和去铁铁载体，证明与非极性树脂的一系列疏水相互作用。极性较大的铁形式比脱铁形式洗脱得更快，显示出指示铁络合(MS）的质量，极性铁离子的洗脱速度快于非极性铁离子，表现出铁络合的质量特征，铁配体电荷转移吸收明显(紫外可见)(B)酰基-去铁胺类铁载体结构。
该研究的结果表明，在海洋沉积物中广泛存在铁载体依赖性的不可培养细菌，并且指向铁载体是在该环境中建立微生物群落的关键组分。许多不可培养的微生物可能需要尚未发现的铁载体类来促进生长。不可培养生物的多样性应根据铁载体受体特异性而广泛变化，本文提供获取新微生物的一般策略。它们的生长可以通过添加外源供应的辅助铁载体或人工提供高浓度的Fe(II)来诱导，这些方法对于发现新的药物很有帮助，因为微生物代谢产物为我们提供的小分子药物是非常有用的。
原文: Siderophores from Neighboring Organisms Promotethe Growth of Uncultured Bacteria
期刊: CHEMISTRY & BIOLOGY
DOI: 10.1016/j.chembiol.2010.02.010
作者: Anthony D’Onofrio et al.
关键词: 不可培养微生物；铁载体；微生物互作
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南京农业大学-土壤微生物与生物有机肥料团队
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