文献直通车：4-1BB共刺激域可以改进由嵌合抗原受体的信号导致的T细胞的耗竭

本文由作者爱康得Robert Wang原创编译（细胞培养俱乐部独家授权）

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4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors

摘要：

靶向CD19的嵌合抗原受体在血液系统恶性肿瘤中产生了明显的抗肿瘤效果，但是靶向其他抗原则少有如此明显的抑制肿瘤效果。 CD19CARs对恶性血液肿瘤的显著的作用效果是与它对恶性血液肿瘤有有更强的敏感性有关，还是与CD19 CAR本身强大功能有关，到目前仍然是未知的。我们发现，由CAR的单链可变片段的抗原独立簇触发的CARCD3-z磷酸化，能够诱导早期CAR-T细胞的凋亡，这样能够限制其抗肿瘤能力。在所有CAR的研究中，这种激活几乎都有不同程度的出现，除了CD19 CAR。我们进一步确定CD28共刺激域能够增强，而4-1BB共刺激域能够减少由CAR持续信号导致的衰竭。我们的结论为CD19 CARs的抗肿瘤活性提供了生物学解释，并且观察到包含有4-1BB共刺激域的 CD19CAR-T细胞比包含CD28共刺激域的CAR，在临床上有更具有持久性。

表达CAR的基因修饰的T细胞是一种有前景的癌症过继免疫治疗方案。CARs是合成的免疫受体，能够与抗原结合域相结合，通常是单链可变区片段（scFv），赋予T细胞独立与组织相容性符合物的特异性。临床试验证实了CD19CAR-T细胞对于B细胞恶性肿瘤具有明显的活性。然而，在临床试验中，靶向其他抗原的CAR仅仅显示了有限的抗肿瘤活性。是否反应了这种治疗方案对恶性血液性肿瘤有增强的敏感性，或者CD19 CAR的结构与靶向其他肿瘤抗原的CAR相比，本身具有更强的功能，到目前为止，仍然是未知的。

已经得到公认的是，过继移植T细胞的抗肿瘤活性需要有效的表达和在体内持续性的存在，但是目前我们几乎不知道CAR的结构是如何影响这些特性的。在发展靶向肉瘤表面的二唾液酸神经节苷脂GD2的CAR过程中，我们发现在体外癌细胞溶解中，有一些CAR表现强效，但是在免疫缺陷的异种移植小鼠体内，显示了有限的扩增、持久性和抗肿瘤活性。在长期抗原暴露的环境中，细胞衰竭是限制抗病毒和抗肿瘤反应的主要因素。衰竭的T细胞具有较低的增殖能力和细胞因子生产能力，具有更高比例的死亡和表达高水平的抑制受体，如PD-1,TIM-3 and LAG-3。是否衰竭会在限制CAR的有效性中扮演一个信号角色，CAR的结构设计是如何影响衰竭的发展，在之前是没有研究过的。

这篇文章中,我们说明了早期的T细胞衰竭是限制CAR-T细胞抗肿瘤活性的主要因素，此外CAR的结构在诱发CAR-T细胞长期活性和衰竭具有核心作用。通过研究体外CD19和GD2 CAR活性的差别，显示了两者体外的细胞毒性相当。我们发现，抗原独立信号能够驱使CAR-T细胞早期衰竭并在体外限制其抗肿瘤活性。此外，我们发现对于GD2 CAR而言，tonic活化和衰竭并不是独特的，在所有CARs测试中，我们均有不同程度的发现，除了具有高效性的CD19 CAR。

 CARs通常包含了CD3-ζ和一个共刺激域来提供完全活化T细胞的所有信号。虽然不同的供刺激域在临床前试验中均有评价，但是CD28和4-1BB这两个共刺激域是在临床试验中最常测试的。最近一个报道说明了包含4-1BB的CAR-T细胞与其他包含CD28的CA19 CAR-T细胞相比，具有明显增强的持久性。使用GD2 CAR作为长期CAR信号研究的模型，无论是通过抗原依赖的信号或者是持续暴露在抗原中进行诱导，我们还发现CD28胞内区增大，而4-1BB胞内结构域的改进，是细胞衰竭的关键因素。因此，这些数据提供了包含CD28或4-1BB共刺激域的CD19 CAR-T细胞体外持续性的不同的生物学基础，也是第一次识别与4-1BB信号相关的抗衰竭作用。

结果:

GD2.28zCAR T在体外有强大的抗肿瘤活性，但是在体内的活性却很弱

在一个尝试发展表达GD2肿瘤细胞的CAR，我们设计了一个2代，包含14g2a来源的scFv片断的GD2特异性CAR结构，并且在其中增加了CD28和CD3-ζ信号域(GD2.28zCAR)。IgG1的CH2CH3间隔域被整合到其中来促进CAR表面表达的检测。表达GD2.28z CAR的T细胞在体外能够有效的溶解GD2+骨肉瘤细胞系143B，但是在异种移植的小鼠体内没有能够介导抗肿瘤活性。没有间隔域的GD2.28z CAR(GD2.sh.28z CAR)在体内也没有抗肿瘤活性，这说明了没有抗肿瘤活性不是由于间隔域触发的激活诱导性细胞死亡。具有相同信号域(CD19.28z CAR)和同样体外活性的CD19-CAR在体内能够对CD19+NALM6-GL 淋巴细胞产生迅速和完整的清除。这些差异促使我们探讨GD2.28z and CD19.28z CARs在体外的活性是否有差异，虽然两者在体外的细胞毒性能力相似，究竟是与CAR结构本身能力的不同，或者是这些肿瘤细胞对T细胞治疗的敏感性有所不同。

为了控制与肿瘤相关的差异，我们在143骨肉瘤细胞表面稳定的表达CD19，体外细胞毒性实验表明，GD2.28z CAR和CD19.28z CAR T细胞对于143B-CD19在体外具有相媲美的溶解能力。然而，在体内的抗肿瘤能力能够观察到明显差异。GD2.28z CAR T对于143B-CD19肿瘤细胞的生长没有影响，但是CD19.28z CAR T能够对143B-CD19肿瘤细胞具有抑制能力。使用CD19.28z CAR T处理小鼠，肿瘤最终会缺乏CD19的表达，然而在GD2.28zCAR T处理的小鼠体内，肿瘤的生长最终会保持GD2 的表达。进一步说，抗肿瘤活性与CAR-T细胞在体内的扩增和持续性有关。我们在移植之后的第14d，很容易在脾脏和肿瘤中找到CD19.28z CAR T细胞，但是却找不到GD2.28z CAR T细胞。尽管体外杀伤效果相当，CD19.28z CAR T能够持久并且对所有CD19+细胞具有杀伤能力，然而，GD2.28z CAR T细胞不能够持久存在，而且不能够抑制肿瘤生长。

GD2.28zCAR T在体外扩增过程中变得衰弱

我们进一步试图来描述GD2.28z和CD19.28z CAR T细胞在体外扩增过程中的差别。T细胞的活化水平在第四天没有明显区别，在第5-7d，GD2.28z CAR T细胞开始增加规模，与CD19.28z CAR T相比，具有更高的CD25和4-1BB的表达，更低的CD27和CD127表达。尽管有增强的活性，GD2.28z CAR T在体外扩增中扩增能力减弱，表现出更高的细胞凋亡率。在第9d，GD2.28z CAR T细胞显示了细胞表面和转录普一致的衰竭，包括更高的PD-1,TIM-3 和 LAG-3表达，与凋亡相关的转录因子T-bet和Blimp-1也是一样的。在暴露于143B-CD19细胞之后，于CD19.28z CAR T细胞相比，GD2.28z CART产生更少的 IL-2, TNF-α和IFN-γ。我们没有发现IL-2增加到培养基中会持续影响细胞衰竭，而且这种表型也不会因为添加IL-7到培养基中而获得解救。此外，这些表型、功能和转导方面的研究表明GD2.28z CAR T细胞会迅速的衰竭，在体外培养 过程中，然而同样的方式刺激，相似的情况不会出现在CD19.28z CAR T细胞中。

GD2.28zCAR对于CAR-T细胞的疗效有明显的抑制作用

为了确认是由T细胞衰竭导致GD2.28z CAR T产生低细胞因子，而不是CAR抗原相互作用能力的差异所致，我们转导T细胞，使其表面表达CD19.28z 和GD2.28z CARs。流式分类共转导(CD19.28z CAR+ GD2.28z CAR+) T细胞群，发现它的表达水平与单个转导CAR T细胞相似，当暴露在143B-CD19(Fig. 2h)和NALM6-GL细胞中，与单独表达CD19.28z CAR的T细胞相比，会产生较低的IL-2, TNF-α和 IFN-γ。因此，GD2.28z CAR 对于T细胞暴露在肿瘤抗原中，表达细胞因子会有一个明显的抑制作用。体内试验中，也重复了共转导CD19.28z CAR 和 GD2.28z CAR的试验(87%纯度)。一个明显的，GD2.28zCAR的抑制作用在体内也被观察到。这些数据说明GD2.28z CAR的低活性与CAR抗原相互作用低，以及暴露在抗原中受损的信号没有关系，而是反映了细胞的衰竭与GD2.28z CAR的表达相关。

在体外扩增过程中，CAR的信号导致了衰竭

我们下一步试图来确定导致体外GD2 CAR-T细胞衰竭的机制。在体外，使用靶向CD3/CD28磁珠来扩增CD19.28zCAR或者GD2.28z CAR-T细胞，但是只有GD2.28zCAR-T细胞会在早期发生衰竭。我们没有发现，在外周血单核细胞培养，暴露在CD19+ B细胞中，能够阻止CD19.28z CAR T发生衰竭。导致我们推测，通过DG2.28zCAR本身的信号在诱导早期的衰竭发挥了重要作用。为了评估GD2.28z和CD19.28z CARs的信号，我们通过磷酸化CD3-ζ的western 杂交来评估CAR磷酸化后的地位。GD2.28z CAR说明了会有基础水平的ζ磷酸化,而CD19.28z CAR显示了仅仅在交联了一个具有独特型特异性抗体后,才会有ζ磷酸化。这些试验数据说明通过GD2.28z CAR，在体外扩增过程中，会有信号传导，通过CD19.28z CAR会有这种信号的缺失。

为了确定GD2.28z CAR信号在衰竭过程中的必需作用，我们通过CD28 和 CD3-ζ区域氨基酸的突变，敲除了GD2.28z CAR信号。在CD28的SH2和SH3 结合点处引入突变，这会促进3-激酶（PI3K）的磷酸化，生长因子受体结合蛋白2（Grb2）和Grb2相关适配器蛋白2（GADS）的结合。突变同样引入到需要通过ZAP70 结合来实现CD3-ζ信号传递的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs）中。GD2.mut-28.mut-zCAR CAR-T 与野生型GD2.28z CAR相比，虽然在表面有相同水平的表达，但是不会显示出过度活化，而且也不会发展为衰竭。通过在独特型特异性交联抗体中培养T细胞，诱导CD19.28z CAR信号，在体内和体外能够重复CD19.28z CAR T衰竭的表型。这些数据使得我们提出这样的假设，通过GD2.28z CAR信号，会导致早期的衰竭。

GD2.28zCAR具有抗原独立性

为了确定GD2.28zCAR信号的主要因素，我们在培养系统中寻求GD2 的存在。活化的T细胞表达低水平的负责GD2合成的酶(比GD2+肿瘤细胞系合成相比，GD3合成少36倍，GD2合成少205倍)，而且我们也没有证据表明活化细胞表面有GD2的表达。然而，为了排除细胞表面GD2低水平的可能性，可溶性GD2或者其他与互补结决定区相互交叉反应的抗原负责GD2.28z CAR信号，我们在GD2.28z CAR的抗原结合域 引入了几个突变，来除去抗原结合。GD2.mutCDR.28zCAR在体细胞表面有效表达，但是不能溶解GD2阳性肿瘤细胞，也不能结合到14g2a独特型抗体。尽管他们不能结合抗原，表达GD2.mutCDR.28z CAR的T细胞仍然会表现出早期的衰竭。我们还合成了可溶性的GD2和CD19单链抗体来评估活化的T细胞的表面结合的交叉反应的抗原，但是什么都没有得到确认。我们断定通过GD2.28zCAR的信号不是由于在培养系统中的GD2或者一个交叉活化的抗原。

GD2.28z CAR的信号是由于CAR的聚集

GD2.28z CAR信号的抗原独立性说明GD2.28zCAR的结构，不同于抗原结合位点，负责构成的信号。很多描述体外scFv聚合反应的研究，我们假设GD2.28z CAR scFv自身相互作用可能会导致受体聚集和增强信号。以CAR–荧光蛋白融合来构建保留的功能（Fig. 10a），我们发现CD19.28z CARs 均匀的分布在T细胞膜的表面，然而GD2.28z CARs聚集在表面（图4c、d和补充图10b）聚集不是由于活化,而是由于通过CAR受体信号产生，因为GD2.mut-28.mut-z CAR T细胞也说明了一个点状表型。与此一致的是，与CD19.28z CAR细胞相比，转导了荧光蓝的CAR 和金星融合蛋白CAR 的T细胞显示了较高强度的förster共振能量转移信号（Fig. 10c)。这些数据与模型一致， CAR受体之间的抗原独立物理相互作用导致的GD2.28z CAR增强信号一致，导致细胞表面的自我联合和聚集。

两个结构成分，铰链和间隔域，在CD19.28z 和 GD2.28z CARs之间差别明显，因此，我们将CD19版本替代到GD2.28z CAR中，来评估早期衰竭的影响。既不整合CD19铰链区，也不除去IgG1间隔域(GD2.sh.28zCAR； Fig. 1a 和 Fig. 8d)，都会引起CAR的衰竭(Fig. 4e,f)。相反地，使用GD2.28z CAR scFv替代CD19.28z CAR scFv框架区域，会在CD19.28zCAR中产生早期的衰竭(CD19-CDR.GD2-FW.28z CAR; Fig. 4g,h)。虽然在GD2.28z CAR中，通过CD19scFv框架结构的替代来阻止其衰竭，但是有这种结构的CARs 在T细胞表面不表达，因此无法充分评估。我们得出结论，14g2a scFv的框架结构对于诱导在强化的信号是必需的，能够过度活化和导致CAR-T细胞的早期衰竭，这就在本质上限制了其抗肿瘤效果。

体外衰竭的发生在CAR-T细胞中有不同程度的发生

为了评价体外的衰竭对于GD2.28z CAR是否是一个独特的现象，我们评估了表达三种其它CARs的T细胞的活化和衰竭：特异性靶向CD22的两个CARs(HA22 或者m971scFvs)，一个特异性靶向ErbB2的CAR(4D5scFv)，所有的都与GD2.28z CAR相同，融合了cd28-cd3 -ζ信号域。

体外培养之后，我们观察到不同程度的活化，伴随着CD22-HA22.28z CAR T细胞显示了低水平的活化， 然而CD22-m971.28z和ErbB2.28z CAR T显示了高水平的活化（Fig.11a)。这些细胞在体外培养过程中展现出不同程度的增强的活性，这与衰竭标记物（Fig. 11b–d)和衰竭相关的转录因子(Fig.11e)的表达的增加有关。我们认为tonic活化导致早期的衰竭很可能出现在大多数scFv为基础的CARs中，除了CD19CAR。

4-1BB内域改善CAR-T细胞的衰竭

最近的临床试验已经说明了整合了CD28与4-1BB共刺激域，CD19 CAR T会有不同的持续时间。因为衰竭的T细胞被认为在体外持续性不好，我们尝试来评估共刺激域是否会影响慢性CAR信号衰竭作用的发展。我们使用GD2 CAR作为一个慢性CATR信号传导的模型，我们对比了负载WT GD2.28z CAR的细胞(同时有CD3-ζ和CD28)与单独通过CD3-ζ和CD28的CARs 的细胞。这些研究证实了CD3-ζ信号在衰竭中的重要作用。然而，与单独的CD3-ζ信号相比，通过WT受体信号（其中包括CD3和CD28ζ），会有更高的衰竭标记物表达和更高的衰竭相关转录因子的表达，这说明了CD28内域会增强这种模型系统的衰竭。

我们接下来尝试来研究4-1BB内域是否会转变这个系统中衰竭作用的发展，通过发展融合了4-1BB而不是CD28 的GD2CARs (GD2.BBz CAR; Fig. 1a 和Fig. 8f)。与GD2.28z CAR T细胞相比，GD2.BBz CART细胞显示了相似水平的过度活化，然而GD2.BBz CAR T细胞显示了低水平的衰竭标记物表达，产生了低水平的细胞因子并且在体外介导增强的抗肿瘤作用。GD2.BBzCAR T细胞在体外也显示了增强的持久性，并且在体外减低了衰竭标记物的表达。同样的，我们观察到了CD22-m971.BBzCARs与CD22-m971.28z CARs相比，具有增强的持久性和抗肿瘤作用，这也显示出了体外扩增过程中tonic活化的证据。此外，4-1BB改善了CD19 CARs的衰竭，我们发现白血病小鼠治疗之后，具有增强的持久性和衰竭标记物的表达减少。我们的结论是，CD28内域增加衰竭，而4-1BB内域可能提供一种抗疲劳的信号，无论是通过抗原依赖的信号或高肿瘤负荷，可以减轻慢性CAR信号引起的不良影响。

4-1BB改善衰竭与一个独特的转录谱相关

接下来我们试图确定分子途径，有助于改善作用4-1BB信号对CAR-T细胞的耗竭。未转导的全面的转录谱和来自3位捐献者的CAR-T细胞在初始德体外活化之后的第9d进行分析。主成分分析表明，尽管供体变异，转录谱是根据CAR的表达进行分类。 表达CD19.28z和CD19.BBz的CAR具有全面的转录谱，与非转导的T细胞类似，然而表达 GD2.28z 或者GD2.BBz CARs的T细胞与非转导的和CD19 CAR-T 细胞差异明显，并且彼此也不相同。

基因集富集分析（GSEA）表明，GD2.28z CAR T细胞显示了丰富的基因，其在小鼠模型的衰竭T细胞中表达上调。虽然在GD2.BBzCAR T细胞中有一些衰竭相关的基因表达也有上调，一些先前描述为对衰竭有关的关键基因在GD2.28z 和 GD2.BBz CAR T 细胞中表达是不同的，有可能会导致GD2.BBz CAR T功能的增强。尤其在GD2.28z CAR-T细胞中展现了更高水平的某些基因表达，这些基因编码抑制受体，如LAG3, HAVCR2 (TIM-3), CTLA4, BTLA and CD244 (2B4),还有一些编码衰竭相关的转录因子，如TBX21 (T-bet), EOMES, PRDM1 (Blimp-1) 和IKZF2(Helios)。这些结果说明一些衰竭相关的分子数量的减少，可能会导致我们观察到的GD2.BBz CAR T细胞中功能改进。

我们也比较了GD2.28z 和 GD2.BBz CAR T细胞，来确定可能导致在GD2.BBz CAR T细胞中观察到的功能的增强。GD2.BBz CAR T细胞中，使用分子特征数据库确定出来的基因进行基因集富集分析，与组织缺氧相关的基因包含了32个基因。其他丰富的基因集包括参与调节细胞代谢的细胞凋亡的负调控/程序性细胞死亡的基因。此外，我们采用一个GD2.28z, GD2.BBz 和 CD19.28z CAR T转录谱的三维对比，来确定在GD2.28z CAR T细胞中独特失调表达，但是在GD2.BBz CAR T细胞中正常表达的基因。与基因集富集分析发现相似的是，辨别出的34个基因中有很多与缺氧反应相关联（EGLN3, EGR1, PTGIS, ID1），细胞凋亡（ID1），代谢（glul，Atp10d，smpdl3a），或T细胞抑制性通路（CTLA4、CD38、lgmn，clecl1，entpd1，KLRC1 / 2）。我们的数据表明， 4-1BB能够部分的改善衰竭，通过减少已知的衰竭基因的表达，但是它也可能是通过调节代谢、凋亡和/或缺氧反应途径来发挥这个功能。

讨论：

使用CD19 CAR-T细胞治疗后的令人印象深刻的早期临床试验说明了 CAR治疗方式是一个以免疫为基础的有前景的癌症治疗方式。然而，到目前为止，这种成功并没有在CD19阳性的其它肿瘤中出现，我们仍然不清楚这种嵌合受体本身的变化能力到达什么程度。在这里，我们提供了一个没有预期到的结果：整合了14g2a 抗体scFv 片段的GD2CARs在靶向CD3/CD28为基础的体外扩增过程中，出现信号增强的现象，这诱导了CAR-T细胞的衰竭。这种衰竭与发生在癌症环境和慢病毒感染环境中的非改造过的T细胞的衰竭似乎没有什么差别，其特征是有改变的转录谱，高表达衰竭标记物，低繁殖能力，低细胞因子产生和较差的体内抗肿瘤活性。

观察到的CARs的tonically信号，导致了T细胞功能受损和衰竭，说明了优化CAR工程的重要性以及需要增强对受体结构如何影响功能的理解。我们的工作说明了CAR的结构特征能够严重的影响这些新型受体的功能。与我们的结果一致的是，由Frigault等人报道发现一些CAR的组成信号，与体内的较差的疗效有关。我们的研究可能可以解释这个现象，CARs聚集，CAR CD3-ζ区域的磷酸化，tonicT细胞的活化和最终T细胞的衰竭。我们进一步探寻导致GD2 CAR聚集影响scFv框架区域的原因。这与其他很多文献的报道是一致的：scFvs和其他抗体片段经常发生寡聚体，并且可能引发tonic信号影响很多整合了其他scFvs片段的CARs的功能。事实上，我们观察到了大量的抗体独立活化和发生在集中不同CARs上的衰竭现象。

我们的试验结果说明了常见的体外细胞毒性试验可能不足以预测CAR在体内的疗效，因为衰竭的GD2.28z CAR T细胞在51Cr释放试验中，仍然具有细胞杀伤能力，但是其在体内只有很弱的细胞因子产生和很差的体内活性。这种分裂的功能已经在之前的衰竭细胞中报道过了。在CD107a脱颗粒的检测中，与CD19 CAR T细胞相比，我们检测到了GD2 CAR T的脱粒能力，但是显著降低。我们的结果表明，CAR-T细胞对于抗原的暴露，多功能细胞因子生产的能力能够更好的预测CAR-T细胞在体内的活性。

我们对于CAR-T细胞衰竭的评价是基于一个tonically信号的CAR，虽然我们的结果对于CAR治疗失败的潜在机制也已经有了更大的影响。肿瘤反应性T细胞耗竭是肿瘤免疫逃避的一个日益完善的机制。CAR的外在因素，如高肿瘤负担，也很有可能导致肿瘤衰竭和限制这些细胞在体内的疗效。我们的数据说明，整合4-1BB到CAR中，改善了衰竭的发展，并且与4-1BB信号能够增强T细胞功能的报道一致。最近的报道，他们提供的解释也说明整合了4-1BB共刺激域的CAR-T细胞与整合了CD28共刺激域的T细胞相比，在临床试验中，具有更好的持久性。

tonic T 细胞信号的环境中，导致细胞衰竭的机制是复杂的，并且所致甚少。为了更好的了解4-1BB信号是如何改善T细胞的衰竭，我们对比了包含CD28和4-1BB共刺激域CARs的转录谱。除了与GD2.28z CAR T细胞相比，GD2.BBz表面表达的衰竭相关的分子表达变少，我们也确定了GD2.BBz CAR T细胞上调的三个途径：T细胞对缺氧的反应，细胞代谢和细胞凋亡的负调控。缺氧诱导因子最近报道了能够增强慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染环境中T细胞的功能，代谢能影响T细胞的功能和记忆的形成变得越来越明显。这些途径对T细胞衰竭的改善作用的程度应该是我们研究的一个重点。

总结一下，我们的工作暗示了T细胞的衰竭是一个限制CAR-T细胞功能的主要因素。事实上，CARs的类型能够驱动CAR-T细胞的衰竭，而抗原独立激活和发生在各种CARs中的不同程度的衰竭，也强调了优化CAR结构的重要性。这篇报道也发现4-1BB具有一个CAR-T细胞衰竭有效的缓和作用，因此暗示了一个使用不同刺激域增加不同CAR-T细胞持久性的一个基础，为人类T细胞衰竭提供了一个新的生物学视角。