59届血液年会(ASH)临床进展：基于非病毒系统开发的多项CAR-T疗法，有效性和持久性彰显巨大潜力丨医麦黑科技

今天是2017年11月27日

农历十月初十

医麦客：有效性和持久性凸显竞争力

2017年11月27日/医麦客 eMedClub/--2017年12月9日，一年一度的美国血液学会(ASH)年会将在亚特兰大隆重开幕。近日，ASH年会摘要已火热出炉，其中专注于开发新型CAR-T疗法，致力于将最佳的基因编辑技术转化为挽救生命的治疗药物的Poseida Therapeutics公司也公布了多项重量级临床进展。

自体CAR-T

P-BCMA-101 的I期临床研究

在血液系统恶性肿瘤中，多发性骨髓瘤属于第二常见的病种，复发频繁，且伴有多种相关并发症。而B细胞成熟抗原(BCMA)作为一种极为重要的B细胞生物标志物，之所以引起极大关注，就是因为它的RNA几乎总是在多发性骨髓瘤细胞中发现，并且该蛋白也被发现存在于多发性骨髓瘤患者恶性浆细胞表面。这两个因素均表明BCMA绝对是值得耕耘的靶点。

2017年，以BCMA为靶点的CAR-T细胞疗法已经显示出了治疗多发性骨髓瘤(MM)的巨大前景。近日，美国生物技术巨头Celgene与合作伙伴Bluebrid刚刚联合宣布，美国FDA已授予其CAR-T疗法bb2121治疗复发难治性MM的突破性药物资格。同时，欧洲药品管理局(EMA)也已授予了bb2121治疗R/R MM优先药物资格(PRIME)

然而，目前的CAR-T治疗策略被过量的短效效应细胞所阻碍，面临着耐久性差、易导致急性毒性以及转导效率低等问题。

P-BCMA-101制造过程(图片来源 poseida)

不同于其他公司的自体CAR-T细胞疗法，由Poseida公司开发的新型的CAR-T细胞产品P-BCMA-101，是将一种非免疫蛋白、全人源的替代支架Centyrin分子融合到标准的第二代CAR分子(a “CARTyrin”)中，并且是用非病毒的piggyBac (PB) DNA转座系统制造的。

P-BCMA-101结构(图片来源 poseida)

piggyBac (PB)基因工程编码三个基因：一个基于iCasp9的安全开关，用于在需要时快速消除产物。一个anti-BCMA CARTyrin和一个用于生产接近100％纯CAR+产物的选择基因。

与用常规方法产生的CAR-T细胞(病毒载体产生的CAR-T细胞倾向于由更多已分化的T细胞亚群组成)相反，P-BCMA-101主要是由经久耐用的记忆性干细胞样T细胞组成(60-80％TSCM )。

P-BCMA-101在体外的活性(图片来源 poseida)

P-BCMA-101在体内的活性(图片来源 poseida)

此前，该公司报道了P-BCMA-101针对MM细胞系(MM.1S、WT或p53-/-(“p53KO”))的体外和体内结果(在9月份结束的波士顿CAR-TCR峰会上，Poseida公布了临床前结果，表明用P-BCMA-101治疗可使所有具有侵略性骨髓瘤的小鼠活下来)。在本次ASH年会上，Poseida公司将公布开报道P-BCMA-101针对多发性骨髓瘤患者的I期临床初步结果。(NCT03288493)

NCT03288493(图片来源 clinicaltrials.gov)

▪ 临床前

方法：使用基于流式细胞术的细胞毒性、CFSE增殖和多重细胞因子诱导测定法，评估P-BCMA-101在MM.1S细胞系和原发性MM肿瘤细胞中的功能活性。同时也在体内测试了P-BCMA-101对抗WT MM.1S细胞、p53KO MM.1S细胞和原发性MM患者的异种移植物施用到人胎儿骨骼中并植入NSG小鼠中的有效性。

结果：对MM.1S细胞和原发性MM肿瘤细胞的特异性杀伤，以及CD4 +和CD8 + P-BCMA-101细胞的显著增殖，展示了P-BCMA-101在体外有效的抗肿瘤活性。此外，共培养上清液的多重细胞因子分析表明主要释放的是IFN-γ和GM-CSF。

为了评估P-BCMA-101在体内的有效性，研究人员对NSG小鼠注射了萤光素酶+ WT或p53KO MM.1S细胞。21天后，小鼠接受单剂IV剂量P-BCMA-101。所有未处理的小鼠表现出迅速的肿瘤生长并伴随着血清M蛋白水平和生物发光成像(BLI)的显著增加，并迅速死于疾病进展。相反，接受P-BCMA-101治疗的100％WT MM.1S攻击的小鼠，在3-7天内，BLI观察到肿瘤的迅速消除，并且所有小鼠在处理后60天保持存活状态，直到研究结束。40％小鼠中，通过BLI观察到肿瘤复发，但是随后被控制(不再施用P-BCMA-101)。

类似地，虽然p53KO MM.1S肿瘤比来源于亲代WTMM.1S系的肿瘤生长更具侵袭性，但是其中5只小鼠中的4只通过P-BCMA-101处理后，肿瘤也被控制到了低水平。有趣的是，一只小鼠的肿瘤保持维持稳定(中等水平)，类似于在人类患者中观察到的疾病稳定不进展。

最后，为了评估P-BCMA-101针对原发性MM肿瘤细胞的有效性，研究人员将来自MM患者骨髓或外周血(PCL)的CD138纯化细胞注射到PDX模型中。具有可测量的血清M蛋白水平的小鼠用单剂量的P-BCMA-101处理。在100％处理的小鼠中， 7天内M蛋白水平迅速下降到检测不到的水平，表明了快速消除存在于人骨碎片异种移植物中的原发性MM肿瘤细胞。此外，这些小鼠在治疗后的存活时间超过60天，显示P-BCMA-101的治疗结果能够达到持久缓解。

结论：在体内外，P-BCMA-101针对BCMA+骨髓瘤细胞显示出特异性、有效的和持久的抗肿瘤活性。并且P-BCMA-101对于p53KO MM.1S细胞也是有效的(出现在耐受所有标准治疗的大部分患者中的高风险MM亚型)。这些结果支持P-BCMA-101用于治疗包括p53分子途径中出现异常在内的复发性/难治性MM患者的临床研究(研究表明，多达一半的复发难治性骨髓瘤患者在p53分子途径中出现异常。患有p53基因突变的患者预后极差，由此导致的癌症对任何可用的治疗方式都没有很好的临床反应)。

通用CAR-T

P-BCMA-ALLO1的临床前进展

慢病毒产生的CARTyrin细胞表现出抗肿瘤效力，但不具有增强的记忆样表型(图片来源 poseida)

以上，我们提到了以BCMA为靶点的自体CAR-T细胞疗法在治疗多发性骨髓瘤(MM)的巨大前景。然而，在个体化基础上生产自体CAR-T细胞却面临着诸如制造时间、重现性、一致性和成本等重大挑战。另外一点需要注意的是，由病毒载体产生的CAR-T细胞倾向于由分化的T细胞亚群组成，而这与较差的体内耐受性相关。

基于以上不足之处，Poseida公司将高保真NextGEN(NG)CRISPR基因编辑系统与非病毒piggyBac(PB)DNA转座技术结合使用，主要在高度可取的记忆性干细胞样T细胞亚群中产生CAR-T细胞，开发了P-BCMA-ALLO1，这是一种现成的(off-the-shelf)同种异体CAR-T细胞产品，克服了以上所提及的这些限制，可以给予任何多发性骨髓瘤(MM)患者。

(左)在供体allo CAR-T细胞上表达的TCR可识别患者MHCI并对正常组织发生反应，导致GvHD

(右)患者T细胞可能识别供体allo CAR-T细胞MHC并排斥移植的的CAR-T细胞

  同种异体反应性损害同种异体CAR-T细胞的安全性和长期持续性(图片来源 Poseida)

其中NextGEN(NG)系统用于破坏P-BCMA-ALLO1中的TCR和MHCI表达，以减少可能的同种异体反应性。在静息T细胞中，NG系统能够进行高效率的基因编辑(>84% for TCRα、>64% for β2M 、>50% for PD-1)。而且在任何off-target的位置都没有检测到不确定事件，从而证明了该系统的精确特异性。

NextGEN CRISPR在增殖和休眠T细胞中进行有效的基因编辑(图片来源 Poseida)

P-BCMA-ALLO1不能介导移植物抗宿主病(GvHD)和移植物排斥反应等同种异体反应。使用临床可扩展的纯化方法，P-BCMA-ALLO1细胞富集至> 99.5％TCR / MHCI双重阴性，并且通过标准的混合淋巴细胞反应(细胞增殖或IFNγ产生)评估同种异体反应性：7-12天基于CFSE的细胞增殖测定和20小时IFNγ-ELISPOT测定。与未编辑的CAR-T细胞相比，P-BCMA-ALLO1对同种异体PBMC刺激没有显示出任何可检测的反应，也没有触发任何高于细胞增殖或IFNγ背景值的同种异体T细胞增殖反应。

基因编辑不影响CAR-T细胞功能或表型(图片来源 Poseida)

在临床前评估中，P-BCMA-ALLO1显示了最佳T细胞表型和有效的体内外效力。超过95％的P-BCMA-ALLO1细胞是CAR+，并且大于50％的产物是CD45RA + CD62L +记忆性干细胞样T细胞(TSCM)，这是一种非常理想的早期记忆T细胞亚群。此外，值得注意的是，CAR-T细胞不表达包括PD-1、TIM-3和LAG-3等在内的任何耗竭标记物，也没有在缺乏靶抗原的情况下表现出强直信号作为IFNγ产生的任何证据。在用BCMA + MM细胞系进行的短期24小时体外共培养测定中，P-BCMA-ALLO1分泌高水平的IFNγ并介导强烈(70-90％)杀死细胞靶标。另外，超过80％的细胞在72小时的基于CFSE的增殖测定中增殖。

P-BCMA-ALLO1在植入MM.1S细胞的NSG小鼠模型(一种侵袭性的人类MM衍生的肿瘤模型)中也显示出强效力。尽管所有对照动物通过生物发光成像(BLI)显示出快速的肿瘤生长并在五周内死于疾病，但是所有经过处理的小鼠在研究期间是存活状态。经P-BCMA-ALLO1给药后，7-10天内肿瘤负荷迅速降至BLI检测的极限。最后，在部分小鼠中观察到几次肿瘤复发，但是随后在没有再次给药的情况下得到了控制。

总之，这些数据表明，P-BCMA-ALLO1能够显著降低同种异体反应性，与此同时保留了强效力，可安全有效地用于治疗任何MM患者。

替代疗法

CAR-T作为干细胞移植的预处理方案

目前，自体或异体造血干细胞(HSCs)移植已被证实能够用于治疗多种恶性和非恶性血液疾病。然而，其制备方案通常会带来严重甚至威胁生命的并发症，因为需要全身辐射和/或化疗的侵袭性和遗传毒性治疗，从而限制了其更广泛的应用。先前试验性的研究已经证实，受体HSCs的消耗是允许成功植入供体HSCs的预处理方案的基本要求。此外，动物和临床研究还表明，同种异体anti-HSC供体T细胞还有助于干细胞植入，但是通常伴随着GvHD(移植物抗宿主病)的风险。

这促使研究人员考虑具有较小毒副作用的可替代的预处理方法来消除HSCs，如anti-c-kit 和anti-CD45抗体导向治疗。这样，通过应用短期的基因工程CAR-T细胞进行干细胞移植预处理也可以实现对HSC的更精确靶向。

基于此，Poseida的研究人员通过使用非病毒piggyBac(PB)转座子系统进行基因修饰，开发了一种新型可控CAR-T方法，用于受体HSC的靶向。与病毒载体递送系统相反，piggyBac(PB)相对大的携带能力允许至少三个单独的基因在相同的三个顺反子转基因盒内被编码。这包括靶向已知在HSC表面上表达的人c-kit(CD117)或prominin-1(CD133)的第二代CAR。另外，耐药元件作为选择基因，与非基因毒性药物组合提供了CAR-T细胞在制造期间纯化的有效方法。重要的是，还包括小分子药物诱导型安全开关基因以促进受体HSC耗尽后和供体HSC移植之前的CAR-T细胞的快速体内清除。最后，由于制造过程，大多数CAR-T细胞表达趋化因子受体如CXCR4，其可以允许更多的选择性运输到骨髓(BM)以根除驻留的HSC。

为了从一组anti-HSC CAR构建体中选择一个候选产品，研究人员首先用mRNA电穿孔处理来自人外周血的CD3/CD28刺激的T细胞，编码每个针对c-kit或CD133的CAR候选物。通过流式细胞术在转染的T细胞中证实CAR表面表达。通过共表达mRNA转染的小鼠或人细胞系(EML-C1、TF-1和K562)的CAR-T细胞，表达c-kit或CD133。小鼠和人BM原代细胞也一样。根据CD107a的表达和IFNγ的分泌，通过脱粒，从它们特异性激活CAR-T细胞中鉴定出了最重要的CAR候选者。此外，那些CAR还能够选择性地消耗c-kit或CD133阳性细胞。

有趣的是，一些mRNA转染的CAR-T细胞即使在其可溶性配体干细胞因子的存在下也保留了靶向c-kit+ TF-1细胞的活性。接下来，在相同的三顺反子转基因中将CAR候选物与选择和药物诱导型安全开关基因共表达，然后使用piggyBac(PB)稳定地递送至T细胞。由CD62L和CD45RA的阳性表达确定的制造过程产生主要是记忆性干细胞样T细胞(Tscm)表型的CAR-T细胞，并且也表达高水平的CXCR4趋化因子受体。与mRNA转染的CAR-T细胞类似，这些稳定转座的细胞能够具有广泛的效应能力，包括表达c-kit或CD133靶细胞的特异性消耗。

进一步的研究将评估预先建立的异种人造血嵌合体以及标准白消安或辐射预处理对照的免疫缺陷型NSG小鼠中，由piggyBac(PB)产生的anti-HSC CAR-T细胞。这种方法构成了一种新型的靶向生物学疗法，设想通过微量的毒性移植方案来消耗BM(骨髓)中的内源性HSCs，并用移植的同种异体或基因校正的干细胞来取代它们。

▪ 关于piggyBac DNA转座系统

相比较于病毒载体的优势(图片来源 Poseida)

不同于一般的CAR-T细胞，Poseida公司的CAR-T细胞不含有scFv结构，而是由全人源的Centyrin结构域组成，基于其专有的piggyBac非病毒基因递送系统进行工程改造。在不使用病毒、细胞因子或磁珠的情况下，完成流线型和可扩展的制造过程，并且能够持续生产出高浓度的患者治疗所需的CAR-T细胞。相比较于传统的基于病毒的CAR-T修饰系统，通过piggyBac技术平台的工作效率要高出30倍。

此外，通过piggyBac技术编辑T细胞还可以获得高比例(> 70％)的记忆性干细胞样T细胞(Tscm)，即使患者自身的这种T细胞亚型非常少。(其他CAR-T细胞通常只含有0-20％的这种Tscm细胞)，而Tscm细胞可能会使得CAR-T产品对患者的治疗更加有效。由Poseida公司开发的这些新型CAR-T产品都具有在治疗过程中产生超高比例的记忆性干细胞样T细胞这一共同特征，所以会产生强有效的持久应答，无需二次治疗。

▪ 关于NextGEN CRISPR基因编辑系统

TALEN、CRISPR/Cas9、NextGEN CRISPR(图片来源 Poseida)

相比TALEN技术只能用于激活的细胞的使用限制性，CRISPR/Cas9由于可能的脱靶突变也存在着潜在的生产上的安全风险。而Poseida公司的新型的混合基因编辑系统 NextGEN CRISPR就可以在解决脱靶突变的同时克服静息T细胞的编辑限制。

使用NextGEN CRISPR产生的同种异体CAR-T细胞既不反应也不被不匹配的同种异体T细胞排斥，这展示了一个真正的同种异体CAR-T产品的制造。此外，基因编辑的CAR-T细胞完全能够杀死肿瘤细胞，并表现出高度有利的干细胞记忆表型(TSCM)，这被认为可能是治疗患者癌症复发的持续控制的关键。

参考出处：

http://poseida.com/2017/11/02/poseida-therapeutics-car-t-programs-featured-three-presentations-american-society-hematology-2017-annual-meeting/

https://ash.confex.com/ash/2017/webprogram/Paper108439.html

https://ash.confex.com/ash/2017/webprogram/Paper106130.html

https://ash.confex.com/ash/2017/webprogram/Paper107698.html

https://clinicaltrials.gov/

  医麦客  丨出品

中国生物医药产业新媒体

转载请联系：[e-mail]

 ☟ 阅读原文  免费加入「个人会员」

申明：文中资讯内容和事件评述仅代表作者观点，如果出现与事实不符或版权侵犯的内容，请速与医麦客平台联系，我们会尽快做出处理，欢迎更多读者朋友关注并给出指导建议。