Nature子刊：杜克大学CRISPR基因编辑治疗严重肌肉疾病，疗效长达一年，Cas9免疫及脱靶会否成为绊脚石？丨医麦猛爆料

2019年2月19日/医麦客 eMedClub/--早在2017年，杜氏肌营养不良(DMD)药物开发商Sarepta与杜克大学签署协议，双方利用基因编辑系统CRISPR研究针对该疾病的潜在治疗方法。现在，杜克大学报告了研究疗法在DMD小鼠模型中有希望的结果，并发表于2月18日的Nature Medicine上。

DMD治疗，亟待破局

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种毁灭性的肌肉疾病，男婴中的发病率为1/5000。据估计，美国约有1.5万名男孩患有DMD，全世界估计有30万名患者。

DMD由X染色体上编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因突变引起，这种突变导致患者肌肉中缺少抗肌萎缩蛋白，特征是进行性肌肉退化和萎缩，导致心肌病和呼吸衰竭而过早死亡。

大多数患者在10岁时就坐轮椅，并且不能超过20岁或30岁出头（图片来源：STAT）

目前，在美国只有一种获批的DMD治疗方法，即Sarepta公司开发的eteplirsen，并且是在没有显著疗效数据的情况下被FDA批准，也反应出对新药的强烈需求。事实证明，在解决这类神经肌肉疾病方面存在很大问题，越来越多的生物技术公司也正在转向基因疗法以求突破。

CRISPR临床前数据，初现长期潜力

先前，基因组编辑已经通过外显子删除、靶向剪接位点或同源定向修复等策略来修复DMD基因。这些研究表明，基因组编辑恢复了DMD小鼠模型中抗肌萎缩蛋白的表达，促使骨骼肌功能的改善。

然而，已发表的研究集中在短期恢复抗肌萎缩蛋白，通常在治疗后4-8周进行评估。

在这项最新的研究中，杜克大学的研究人员证明，基于CRISPR的单一全身治疗可以安全、稳定地在小鼠中纠正DMD超过一年，尽管观察到免疫反应和其他基因编辑结果。

未治疗的DMD小鼠(左)和用基于CRISPR的疗法治疗一年后的小鼠(右)之间对比非常明显。在右侧，绿色表示肌营养不良蛋白基因表达水平较高。插图中的黑斑显示来自这些小鼠的T细胞响应细菌Cas9蛋白，表明存在对治疗的免疫应答（图片来源：Duke University）

自2009年以来，杜克大学的Charles Gersbach博士一直致力于开发DMD的潜在遗传治疗，他的团队是最早开始关注CRISPR/Cas9的实验室之一。

Charles Gersbach（图片来源：Duke University）

治疗原理

该研究团队的方法是使用CRISPR/Cas9来剪切基因突变周围的抗肌萎缩蛋白外显子，使体内天然DNA修复系统将剩余的基因重新拼接在一起，以创建抗肌萎缩蛋白基因的缩短但功能性的版本。

具体而言，mRNA在成熟时需要把内含子剪掉，把剩下的外显子给拼接起来，然后翻译成正常的蛋白质。而DMD患者由于dystrophin基因突变会导致外显子的缺失，由此产生的后果是，缺失外显子的旁边2个外显子得强行拼接起来，这可能导致外显子脱离编码框架，阻碍抗肌萎缩蛋白的产生。

虽然直接跳过不能很好拼接的外显子，从而产生的抗肌萎缩蛋白会缺少几个氨基酸，但仍然具有功能。况且先前的研究表明，将抗肌萎缩蛋白蛋白表达增加至正常水平的15％即可为DMD患者提供显著的治疗益处。

为什么不直接将全长基因拷贝递送至肌肉细胞？

dystrophin是X染色体编码的最大基因，包含约260万个碱基和多达79个外显子，在人类已经发现了超过3000种不同的突变。因此，现有的基因递送载体包装不下如此庞大的基因。

换一种思路，包裹缩短的功能基因拷贝倒是可行的选择。包括Sarepta公司本身也正在临床试验中验证这种策略，其他公司还包括Solid Biosciences、辉瑞/Bamboo Therapeutics等。

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在新的研究中，研究人员利用双AAV(腺相关病毒)系统治疗小鼠，该系统由一个编码SaCas9的AAV和另一个编码两个向导RNA(gRNAs)的AAV组成，这两个RNA是为了切除mdx小鼠模型DMD基因的23号外显子而设计的。

“随着我们继续努力开发基于CRISPR的基因疗法，测试我们的假设并严格评估这种方法的所有方面显得至关重要，”Gersbach说。 “我们实验的一个目标是测试该领域正在关注的一些想法，这将有助于我们了解CRISPR治疗遗传性疾病和特别是Duchenne肌营养不良的潜力。这包括针对细菌Cas9蛋白的潜在免疫反应，监测治疗反应的长期耐久性。”

领导这项工作博士后研究员Christopher Nelson对携带突变型dystrophin基因的成年和新生小鼠静脉内施用单剂量的上述CRISPR疗法。在接下来的一年中，研究人员测量了治疗效果，包括成功编辑了多少肌肉细胞和进行了哪些类型的遗传改变，以及针对细菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫应答的产生。

结果发现，经过全身给药(静脉注射)的小鼠在1年内的基因组编辑水平具有统计学上的显著提高。免疫荧光染色和western blot检测抗肌萎缩蛋白在小鼠心肌和骨骼肌中的持续恢复，并且恢复后的抗肌萎缩蛋白在较年轻的小鼠中略小于年龄较大的小鼠，这可能是由于早期产生的蛋白质异构体较少，而在1年时几乎检测到全长的抗肌萎缩蛋白。

经全身治疗后8周，新生小鼠血清肌酸激酶水平下降，说明抗肌萎缩蛋白恢复后对肌肉的损伤有保护作用。

通过静脉内给药治疗的新生小鼠中基因组编辑持续1年（图片来源：Nature Medicine）

关于Cas9免疫

在体基因组编辑长期疗效的一个重要考虑因素是宿主对细菌来源的Cas9蛋白的反应。

其他研究报道，小鼠免疫系统可以对Cas9产生反应，这可能会干扰CRISPR疗法的益处。一些研究小组还报告说，有些人对Cas9蛋白具有预先存在的免疫力，这可能是因为之前接触过细菌宿主。

“好消息是，尽管我们观察到抗体和T细胞对Cas9的反应，但似乎都没有在这些小鼠中产生任何毒性，”Nelson说。“这种反应也没有阻止该疗法成功编辑并产生长期蛋白质表达的能力。”

研究人员还提出了解决潜在挑战的方法。

例如，研究中观察到，当没有完全发育免疫系统的2日龄小鼠进行静脉内治疗时，没有检测到免疫反应。CRISPR基因组编辑保持稳定，某些情况下甚至在一年内得到加强。因此，新生儿治疗或许可以规避免疫风险。

然而，Gersbach和Nelson承认，小鼠免疫系统的功能通常与人体免疫系统完全不同。况且新生儿DMD筛查目前尚未广泛开展；大多数DMD诊断发生在儿童3至5岁时。

为了应对这一挑战，Gersbach说在治疗期间抑制免疫系统或是一种可行的方法。研究人员还在研究限制Cas9仅在短时间内表达或递送至肌肉细胞的潜在策略，这可能会减少免疫反应。

“我们很高兴地观察到所有小鼠在治疗后一年都表现良好，但我们的研究结果表明，随着我们向更大的动物模型迈进，需要更加关注免疫反应，”Nelson说。

关于脱靶效应

作为CRISPR领域的另一个重要挑战，脱靶效应引起了人们的长期担忧。

Nelson和Gersbach此前曾调查过CRISPR/Cas9的脱靶编辑潜力，即无意中修改了基因组中的其他位点，并报告了可能脱靶位点的最小活性。

然而，去年的其他研究报道，CRISPR有时可以在正确的位点进行基因编辑，但不以预期的方式进行。例如，CRISPR可以切除比预期大得多的基因片段，或者那些DNA片段可以嵌入切割位点。之前在基因组编辑研究中未报告这些类型的编辑，因为所使用的方法仅检测到预期的编辑。

为了更全面地绘制治疗产生的所有编辑，Nelson使用了DNA测序方法以报告任何类型的编辑。令人惊讶的是，除了目标外显子的预期删除之外，还进行了许多类型的编辑，包括来自AAV载体的高水平DNA序列插入。

AAV整合到DMD基因座和全基因组（图片来源：Nature Medicine）

根据组织类型和CRISPR递送的剂量，多达一半的目标(on-target)编辑导致这些替代序列的变化。尽管该结果令人惊讶，但是非预期的序列变化似乎不会影响该CRISPR/Cas9基因编辑方法对DMD的安全性或功效。

“在这种情况下，这些编辑都不一定引起关注，因为dystrophin基因已经存在缺陷，”Nelson说。“话虽这么说，任何意想不到的结果都可能会剥夺你试图实现的基因编辑的效率，未来研究中应设计减轻替代编辑的方法。”

参考出处：

https://www.nature.com/articles/s41591-019-0344-3

https://medicalxpress.com/news/2019-02-crispr-treatment-long-term-benefits-mice.html

https://www.fiercebiotech.com/research/crispr-corrects-dmd-mice-for-a-year-sarepta-supported-study

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