PNAS：基于AAV的基因疗法成功逆转小鼠先天性耳聋丨医麦猛爆料
2019年2月22日/医麦客 eMedClub/--耳聋也被称为听力障碍，是当今医学界面临的最大挑战之一。根据世界卫生组织(WHO)的统计，全世界有5％的人口(约3.6亿人)患有听力障碍。
遗传性耳聋是新生儿常见的疾病，发病率大约1/1000，且80%是常染色体隐性遗传(DFNB)，20%为显性。
（图片来源：杨辉教授-东方科技论坛PPT）
极大未满足的医疗需求
目前治疗耳聋的方法比如助听器、振动声桥及人工耳蜗等。
对于听力损失超出助听器帮助的患者，唯一有效的治疗选择是人工耳蜗(CI)。CI是市场上最成功的感觉假肢装置。许多报告显示，大多数耳聋患者在接受CI后可以在安静的环境中理解言语。
全世界大约有30万名患者接受了人工耳蜗植入，但这仅占所有耳聋患者的一小部分。CI也有很大的局限和弱点，例如频率敏感性、言语分辨及噪声环境下的感知困难。CI是假肢装置，因此需要患者在其一生中非常小心地使用。
（图片来源：The Meducator）
耳蜗基因治疗，有望突围成功
近日，由法国科学家领导的一个国际研究小组利用基因疗法来恢复成年小鼠的听力，这些小鼠患有DFNB9耳聋，这是最常见的遗传性耳聋之一，约占2-8％。
DFNB9耳聋的患者缺乏编码otoferlin的基因，而otoferlin是一种在耳蜗内毛细胞(IHC)突触中传递声音信息所必需的蛋白质。通过耳蜗内注射基因疗法，科学家们成功地将成年DFNB9小鼠模型中的听觉突触功能和听力阈值恢复到接近正常水平。
这些发现发表在著名期刊PNAS上，为DFNB9患者的未来基因治疗试验开辟了新的途径（图片来源：PNAS）
左图是人耳的示意图。外耳由耳廓和外耳道组成，负责声波的收集；中耳由耳膜和听小骨组成，将声波传递到内耳，其中包括耳蜗 - 负责向中枢神经系统传递听觉信息的听觉器官。
右图显示了注射的耳蜗内感觉上皮细胞的免疫荧光图像。耳蜗内毛细胞已被otoferlin染成绿色。 在几乎所有这些细胞中都检测到Otoferlin。插图是高倍数放大区域，显示未转导的内毛细胞。（图片来源：巴斯德研究所）
此前的研究表明，人类和小鼠之间在听觉必需的蛋白质方面存在惊人的相似之处，许多耳聋基因和致病突变在这两个物种共有。因此，小鼠模型在耳蜗基因治疗的临床前试验中最受欢迎。
但值得注意的是，大多数测试中，治疗基因被施用于新生小鼠正在发育中的耳蜗(通常在出生后第1天(P1)或第2天(P2)，这是在小鼠开始能够听到(大约P12)之前。
然而，在人类中，胎儿的耳蜗发育是在子宫内完成的，并且在出生前大约20周就可以获得听力。如果要对正在在发育中的耳蜗中进行基因治疗，这将导致非常小的治疗窗。
实际上，针对耳聋的基因治疗必须在出生后进行，因为往往在幼儿诊断出听力损失及其原因之时，耳蜗已经完全发育。这意味着，治疗必须能够扭转已存在的耳聋，在设计临床前试验时应考虑到这一点。
基因治疗的潜在适应症，独特的优势：
首先，耳蜗高度隔室化，并通过血液 - 耳蜗屏障(BCB)与身体的其他部分隔离，被认为是一种"免疫豁免器官"。上述极大程度地减少了治疗所需剂量(研究成本低)，以及药物渗漏到全身循环系统的风险，以减少不良免疫反应。
此外，耳蜗中的毛细胞和支持细胞通常不分裂，因此耳蜗中的细胞保持稳定，有望利用非整合型病毒载体(例如AAV)进行持续的转基因表达。
眼睛同被认为是“免疫豁免器官”，基于在眼部基因治疗的人体试验中获得的成功，腺相关病毒(AAV)似乎是用于耳蜗基因治疗的有希望的病毒载体。AAV在人眼基因治疗中成功的原因包括：
（1）经证实的安全性 - 大量人体试验表明AAV缺乏致病性并且具有非常低的免疫原性；
（2）在非分裂细胞中长效转基因表达；
（3）AAV的小尺寸(约20nm，比腺病毒小5倍)有助于扩散穿过细胞屏障到达靶细胞。
然而，AAV的有限DNA包装能力(约4.7kb)使得难以将该技术用于较大的基因，例如编码otoferlin的基因(cDNA~6kb)。
为此，在最新的研究中，研究人员通过称为双AAV的策略，克服了这一限制。因为它使用了两种不同的重组AAV载体，一种携带otoferlin cDNA的5'-片段(Otof NT, 核苷酸1-2,448)，另一种携带3'-片段(Otof CT, 核苷酸2,449-5,979)。
感染HEK293细胞的研究表明，两种载体能够通过其反向末端重复重组并产生多联体，并且所得转录物可以正确剪接产生蛋白质otoferlin。
双AAV载体递送后otoferlin在HEK293细胞中的表达（图片来源：PNAS）
实验操作
单次单侧注射AAV-Otof NT加AAV-Otof CT重组载体至Otof -/-小鼠的左耳蜗，在完全发育之前(P10)或之后进行(即P17和P30)，因为内毛细胞(IHC)带状突触在P17成熟，而耳蜗在P30成熟。
P10组
注射重组载体后8周，研究人员对3只Otof -/-小鼠的经处理的耳蜗的感觉上皮进行显微切割并对otoferlin进行免疫标记，以评估IHC转导率。结果发现，60％以上的IHC被检测到相应蛋白质，而不存在于其他细胞类型。
该结果表明，体内局部递送重组AAV-载体对后，可以在耳蜗感觉细胞中有效地重建大的cDNA，并且大部分细胞持续、广泛地产生蛋白质。
此外，听觉脑干反应(ABR)记录证明，所有治疗小鼠具有响应于咔嗒声和音调突发刺激(8、16和32kHz)的听力阈值的实质恢复。注射后30周，P10组的8只治疗小鼠中有6只的听力阈值仍然在野生型小鼠的10 dB范围内。
因此，耳蜗完全发育前的基因治疗可预防Otof -/-小鼠的耳聋。
P17和P30组
注射重组载体对后，P17或P30 Otof -/-小鼠的左耳蜗中均检测到otoferlin，但是在对侧耳蜗的IHC中没有检测到otoferli。两组小鼠的IHC转导率相似(分别为82±9％和85±7％, n=5和n=3），并且高于P10组的IHC转导率。
注射后4周的ABR记录显示，P17组的所有治疗小鼠(n=5)听力恢复，响应于咔嗒声或音调突发刺激的ABR阈值与野生型小鼠中的相似。注射后20周，响应于咔嗒声的听力阈值保持不变，表明这些小鼠的听力持续恢复，尽管平均ABR波幅度约为野生型小鼠的一半(47±10％)。
同样，P30组治疗小鼠在注射后3周显示出类似的听力恢复，并且在注射后20周，ABR阈值在野生型水平响应于持续的咔哒声或音突刺激(n=3)，尽管平均ABR波幅度约为野生型小鼠的一半(55±10％)。
■ ■ ■
这些研究结果记录了DFNB9小鼠模型中局部基因治疗的预防和疗效，同时扩大了人类遗传性耳聋形式的潜在AAV基因治疗应用范围。值得注意的是，该研究中的基因治疗不仅成功地防止耳蜗正在发育的Otof -/-小鼠的耳聋，并且耳蜗完全发育后给药，也能以持续的方式逆转耳聋表型。
对于临床转化，耳蜗与眼睛有许多相似之处。目前，针对眼部疾病的基因疗法已走在前沿，其中许多已进入临床III期，从中获得经验，可为提高耳蜗基因治疗临床成功的提供有价值的指导。
推荐阅读：Akouos获5000万美元A轮融资，下一代AAV载体基因疗法冲击耳聋适应症丨医麦猛爆料
参考出处：
https://www.pnas.org/content/early/2019/02/14/1817537116/tab-figures-data
耳聋动物内耳基因治疗现状 《中华耳科学杂志》, 2018年16卷4期
https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm
https://www.bioportfolio.com/news/article/3906437/Gene-therapy-durably-reverses-congenital-deafness-in-mice-https-medicalxpress-com-news.html
https://futurism.com/the-byte/gene-therapy-deafness-mice
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6028713/
中国肿瘤免疫治疗行业虽然在快速发展，但仍然面临诸多的挑战。2019年医麦客再次邀请数十位包括新药政策制定专家，技术与临床应用专家，新药研发企业代表汇集中国上海，计划于2019年3月23日至24日召开第二届肿瘤免疫治疗技术研讨会，与来自全国500+行业精英一起探讨肿瘤免疫治疗药物的技术革新与发展趋势。
医麦客诚邀您参加
中国·上海
2019（第二届）肿瘤免疫治疗技术研讨会
后台回复“嘉宾”看大会邀请嘉宾
后台回复“日程”看大会详细日程
点击下方，抢先报名！