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2020年8月2日/医麦客新闻 eMedClub News/--免疫系统中，T细胞能特异性识别外来抗原并引发对入侵病原物或者肿瘤细胞的适应性免疫反应，一直以来，T细胞因其强大的肿瘤杀伤能力而成为肿瘤免疫学研究的热点。
T细胞主要是通过T细胞受体（T cell receptor, TCR）来识别抗原，其功能是通过TCRs与主要组织相容性复合体(MHC)分子或人类白细胞抗原（HLA）所呈现的肿瘤抗原短肽的结合而启动的。TCR则是通过其相关的CD3ε，δ，γ和ζ介导抗原诱导的信号传导，但是不同CD3链的具体作用仍然有待探索。目前，在肿瘤免疫治疗领域中，过继性细胞转移（ACT）疗法，尤其是基于T细胞的细胞治疗策略，已经显示出持续的临床疗效。这些细胞被分离或经过基因工程处理，在体外扩增，再回输进患者体内以消除癌细胞。目前，已有两种基因修饰的T细胞（CAR-T细胞和TCR工程T细胞）被开发用于过继转移，并在恶性肿瘤的治疗方面取得了实质性进展。因此，对于这些TCR结构功能的深入探索，对于T细胞治疗策略，尤其是CAR-T疗法的进一步开发有着至关重要的作用。CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞，是一种通过基因工程产生人工T细胞受体的T细胞，它被设计成能使T细胞具有靶向特定蛋白的能力，能直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活，从而更有效地靶向和消灭癌细胞。至今，已经有3款CAR-T细胞产品成功获得美国FDA的上市批准。近日（7月29日），中科院上海生化与细胞所许琛琦团队、北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队，以及美国加州大学圣地亚哥分校惠恩夫团队，联合在Cell上发表了题为“Multiple signalingroles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的研究性论文。该研究揭示了TCR的不同CD3链ITAM结构域磷酸化特征，发现其中一个CD3ε亚群的 ITAM存在单磷酸化的新功能，有望助力设计新型的CAR-T疗法，从而改善其抗肿瘤活性和持久性，并减轻CAR-T治疗产生的细胞因子副作用。
CARs模块化设计有四个主要组件，分别是抗原结合域、铰链（Hinge）、跨膜结构域和胞内信号结构域。每一种组件都有其独特的功能，而CAR的最佳分子设计可以通过蛋白质结构域的多样化来实现。CAR结构（图片来源：参考来源2）
CAR的抗原结合域传统上是由可变重链（VH）、可变轻（VL）链及两者之间的柔性连接物（linker）形成的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）。抗原结合域与一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成了CAR的胞外结构域。抗原结合区识别靶抗原会触发一系列化学和生物理化过程，激活T细胞以杀伤肿瘤细胞。CAR以抗体的scFv（单链可变区）识别肿瘤抗原，从而实现独立于主要组织相容性复合物（MHC）的T细胞活化。铰链区（Hinge）能提供足够的灵活性来克服空间位阻，以便于结合靶抗原。跨膜结构域将CAR锚定在T细胞膜上。胞内结构域通常包括激活区（信号转导结构域）、一个或多个共刺激域。信号转导结构域通常为T细胞受体TCR /CD3ζ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序（基于免疫受体酪氨酸的活化基序，ITAM），因此绝大多数CAR通过CD3ζ衍生的基于酪氨酸相关的免疫受体激活CAR-T细胞。基于对CAR的四个模块组件的创新设计，有望提高CAR-T细胞治疗的安全性和有效性，扩大其在肿瘤治疗领域的应用范围，促进快速、可靠和高效地生产CAR-T细胞。如上文所提到，TCR在抗原刺激下，通过其相关的CD3ε，δ，γ和ζ亚基介导抗原诱导的信号传导，但是不同CD3链的具体作用尚有待探索。在此次研究中，研究团队通过定量质谱技术，同时定量分析了TCR激活过程中所有CD3链的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)的磷酸化情况。发现TCR在不同的刺激条件下，CD3各亚基的ITAM主要表现为双磷酸化修饰模式；但是由于Lck激酶的选择性，唯独一个CD3ε ITAM亚群存在单磷酸化的新功能，并且可专门募集抑制性Csk激酶来抑制TCR信号传导，这表明TCR是一种自我控制的信号传导机制，既包含激活基序又包含抑制基序。此外，研究者还进一步将CD3ε胞质结构域整合到第二代CAR中，发现可改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性。具体来说，CD3ε的ITAM结构域可以通过募集Csk减少CAR-T细胞因子的产生，而CD3ε的BRS（basic residue rich sequence）序列通过募集p85促进了CAR-T细胞的持久性。▲ 图片来源：参考出处1
总的来说，CD3ε是一个内置的多功能信号调节器，并且不断增加的CD3多样性有望不断推进下一代CAR的设计策略。
CAR是以抗体的scFv（单链可变区）识别肿瘤抗原的，scFv序列是CAR-T研发中的核心技术，筛选一个合适的scFv序列，时间成本和费用成本都不低，且人源化的比鼠源更高，但以“人源化”CAR-T代替“鼠源化”CAR-T可降低排斥作用，降低复发率，提高CAR-T的安全性和有效性。
scFv由重链、轻链以及之间的linker连接而成，将不同的重链和轻链随机组合，可以建成人源化的scFv组合抗体文库，再通过表达量、稳定性、与抗原的亲和力等指标进行筛选。目前已经有CD19，CD22，CD30，BCMA等全人源CAR-T用于临床试验。
其中由驯鹿医疗和信达生物制药联合开发的CT103A（靶向BCMA），它以慢病毒为基因载体转染自体T细胞，CAR包含全人源scFv、CD8a 铰链和跨膜、4-1BB共刺激和CD3ζ激活结构域。基于严格的筛选，通过全面的体内外功能评价，CT103A CAR-T产品在复发/难治性多发性骨髓瘤(RRMM)患者中具有强有力和快速的疗效，并有突出的持久性。
2019年12月举办的第61届ASH年会上，华中科技大学附属同济医院开展的一项研究者发起的临床研究(IIT)中，CT103A获得了令人印象深刻的安全性、有效性和持久性，在已完成的18例经典I期爬坡试验中，可评估的17例患者，客观缓解率（ORR）达100%，完全缓解（sCR/CR）为70.6%，很好的部分缓解（VGPR）或更好的疗效为88.2%。
17/18例患者发生CRS（1-2级72.2%（13例），3级16.7%（3例），4级5.6%（1例））。最低剂量组（1*10^6 cells/kg）中，2级或以下的CRS发生率为88%，但总体可控且无神经毒性。
值得注意的是，该研究还包括4名先前已接受过鼠源抗BCMA CAR-T治疗后复发的受试者，他们整体表现表明，CT103A还可以为鼠源性CAR-T治疗后复发的患者提供一种再治疗的选择。2019年9月10日，CT103A获得了NMPA 的IND默示许可(受理号：CXSL1900060)，预计将于2020年初开始II期临床试验。为了找到比FDA批准的两种CAR-T疗法中使用的更安全的CAR(嵌合抗原受体)分子。美国南加州大学(USC)、北京马力喏公司与北京大学的研究人员合作，设计了一种新型的抗CD19 CAR 分子（CD19-BBz(86)）。他们使用了三级结构预测程序(Phrye2)的指导，通过基因改造编码CD19-BBz CAR构建体原型(CD19-BBz(71))中CD8α分子胞外和胞内结构域的序列，创建了一组代表性CD19-BBz变异体，并鉴定了产生细胞因子能力降低的CAR变异体。
CD19-BBz(86) CAR T细胞产生较低水平的细胞因子，表达较高水平的抗凋亡分子并且比第二代抗CD19 CAR原型CD19-BBz CAR-T细胞增殖更慢，使患者的身体有更多时间清除血液中的细胞因子；同时保留了有效的细胞溶解活性。因此，CD19-BBz(86) CAR T细胞具有良好的治疗效果，且不会引起严重的CRS和神经毒性。
2019年4月22日，发表在Nature Medicine的一项最新研究中，CD19-BBz(86)CAR-T细胞在25名难治性淋巴瘤患者中，均没有产生严重的副作用。尽管该研究旨在考虑安全性而非有效性，但接受常用剂量的11名参与者中有6名完全缓解。
目前研究人员正在计划在更大群体的患者中进行2期研究。如果进一步的研究证实了这些早期的测试结果，CD19-BBz(86) CAR-T有可能克服这两个通常限制CAR-T细胞治疗有效性的副作用。值得一提的是，该CAR-T产品已在2018年10月8日获得中国的临床试验许可批件(CXSL1700122)。依赖于小分子衔接配体的CAR-T细胞开关：CAR可以被设计成识别双特异性衔接分子，这些衔接分子也包含与癌细胞上表达的受体(例如，叶酸受体)结合的分子，从而连接CAR-T细胞和癌细胞；这些半衰期短的小分子衔接器的剂量可以动态控制，以防止或终止CRS。（图Aa）具有潜在毒性的CAR-T细胞产品也可以通过各种“on-switches”进行控制，包括通过药物调节CAR结构的瞬时激活结构变化，例如不同肽链的二聚作用，包括解离、反式激活和共刺激域。（图Ab）
图A.依赖于小分子“On/off 开关”的CAR（图片来源：参考来源2）Mestermann等人证明了酪氨酸激酶抑制剂dasatinib（已被FDA批准治疗费城染色体阳性慢性粒细胞白血病）通过抑制LCK干扰CAR活性，从而干扰CD3ζ激活域下游的信号。因此，dasatinib可迅速且可逆地阻止CAR-T细胞的激活。并且，在小鼠淋巴瘤模型中CAR-T细胞输注后不久(3小时)给予dasatinib，可显著降低CAR-T细胞诱导的CRS死亡率。如果这些观察结果在临床研究中得到验证，dasatinib可以提供一种现成的、可逆的、耐受良好的药理学安全开关，与许多其他安全开关不同，它不会导致CAR-T细胞的消失。（图Ac）另一种动态快速控制CAR-T细胞功能的策略涉及到使用基于蛋白酶的小分子辅助关闭CARs(SMASh-CAR)，也称为switch-off CARs (SWIFF-CARs)，来调控T细胞表面的CAR表达。在这个系统中，蛋白酶的目标位点和蛋白酶被嵌入到CAR结构中，与促进CAR蛋白降解的“degron ”片断一起。在“on”状态下，目标位点断裂，CAR蛋白中的“degron ”片段被去除，CAR在T细胞表面表达；而在使用外源性小分子蛋白酶抑制剂后，CAR蛋白没有被断开，“degron ”片段保留，从而CAR通过蛋白水解途径降解。（图Ad）因此，安全开关有望在毒性反应出现时消除CAR-T细胞；然而，在临床实践中，CAR-T细胞通常对皮质类固醇和化疗药物(如阿糖胞苷和氟达拉滨)敏感，这些药物在这些安全开关失效时提供可靠且广泛可用的支持。另一种控制CAR-T细胞细胞因子毒性的策略是将“关闭开关”或“自杀基因”植入CAR结构，当细胞因子介导的毒性或脱靶效应发生时，提供一种方法使CAR-T细胞失活。这种方法主要是通过诱导细胞凋亡或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或互补依赖性细胞毒性(CDC)来消除CAR-T细胞。图B.“自杀基因”植入CAR结构（图片来源：参考来源2）
凋亡启动融合蛋白已被已开发成一种更快速的安全开关，该蛋白由caspase 9与FK506结合蛋白FKBP1A的修饰形式结合组成 (iCasp9)，后者通过与一种系统管理的生物惰性小分子AP1903结合能有条件的使融合蛋白二聚化和激活。在一项临床试验中，5名患者接受了同种异体造血干细胞移植治疗急性白血病，随后接受了iCasp9修饰的供体T细胞，以增强免疫重建;随后于4例发生移植物抗宿主病(GVHD)的患者中应用该二聚剂，在30分钟内清除了90%的修饰T细胞，并消除了GVHD，显示了该方法快速消耗CAR-T细胞的潜力。（图Ba）另外一些已经被开发出来的方法是基于CAR和人细胞表面抗原的共表达，FDA已经有批准的治疗性抗体，包括可以用rituximab（利妥昔单抗）靶向CD20，或者可以用西妥昔单抗靶向EGFR的胞外和跨膜结构域。（图Bb）敲除细胞因子基因或表达细胞因子拮抗剂。使CAR-T细胞先天具有分泌中和相关细胞因子的能力。图C.图片来源：参考来源2
“逻辑门控”条件表达系统
合成生物学模式被用来增加CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性，这些肿瘤细胞是经过多种抗原检测的，以克服缺乏独特的肿瘤特异性抗原的问题。synNotch系统包括使用一个合成的Notch受体（ synNotch受体）来识别一个TAA，其激活可诱导一个编码特异性靶向第二TAA的CAR表达，并包含T细胞激活域，从而创造一个“and”逻辑门控（logic gate），需要同时存在两个细胞表面抗原才能激活CAR-T细胞。
▲图B.逻辑门控and/or条件表达系统（图片来源：参考来源2）
可供选择的策略基于逻辑门控and/or条件表达系统。逻辑门控and/or条件系统：针对特定TAA的CAR的表达依赖于另一种转基因TAA受体（比如synNotch受体）的激活，必须结合多个TAA才能完成CAR-T细胞激活；或者由与肿瘤微环境（TME）相关因素，比如缺氧（缺氧诱导因子，HIF）诱导表达。基于此，人们也已经开发了相应的方法来限制CAR-T细胞活动的空间分布和持续时间，以限制全身的脱靶毒性。例如，利用低氧诱导因子1α（HIF1α）降解途径来限制，只有CAR-T细胞位于肿瘤低氧微环境是才表达CAR，从而减少对非恶性组织的负面影响(非恶性组织主要是非低氧状态)。(图Bb)synNotch系统已被用于靶向表达抗原ROR1的肿瘤细胞，该抗原也存在于骨髓基质细胞和其他组织中;与单独靶向ROR1的传统CAR T细胞相比，门控上皮细胞粘附分子(EpCAM)或B7-H3作为二级抗原的表达可增加肿瘤细胞特异性，降低动物模型的毒性风险。然而，这种逻辑门控CAR-T细胞的缓慢激活可能会限制这种方法的有效性，而与逻辑门控效应类似的通过靶向多种抗原或通过其他刺激或抑制手段来提高特异性的策略也在开发。
与逻辑门控效应类似，通过连接CD3ζ和共刺激域分离的受体，即一个受体具有CD3ζ激活域，第二个受体具有共刺激域，每个受体识别不同的抗原(因此使用第一代CAR 构造结合嵌合共刺激受体)，需要绑定到多个TAA才能完成CAR-T细胞的活化。(图a)
▲分裂CAR（图片来源：参考来源2）
这种方法的前景已在前列腺癌、乳腺癌和其他实验系统的临床前模型中得到证实。类似的方法还包括利用次级嵌合细胞因子受体靶向肿瘤细胞分泌的细胞因子（如IL-4），来限定T细胞对肿瘤组织的活性 ，尽管这些炎性细胞因子的缺点是严格来说它们不是肿瘤特异性的。(图d)
▲图片来源：参考来源2
一个与此相关的策略是基于抑制CAR（iCAR）的使用，这种设计是为了抑制T细胞与非恶性细胞上表达的抗原结合后的激活，从而确保共同表达的激活CAR产生的信号只发生在肿瘤上。不同于共刺激域，iCAR包含免疫检查点蛋白衍生的抑制性域，如CTLA-4或PD-1，从而共同选择内在的免疫检查点信号通路。(图b)
另一种降低传统CAR-T细胞先天毒性潜能的方法是将CAR引入T细胞亚群，使其具有更好的抗肿瘤和安全性。例如γδT细胞，是一种先天具有肿瘤识别能力的T细胞亚群，通过表达带有γδ亚型的TCR(而不是更常见的α β亚型)识别肿瘤细胞代谢紊乱而特异性表达的磷酸化抗原。(图c)体外实验中，向γδT细胞转导一个靶向GD2的CAR，该CAR只有一个共刺激域导致细胞溶解的反应，针对GD2阳性的神经母细胞瘤细胞而不针对GD2阳性的非恶性组织(因为CD3ζ信号只由与内源性γδTCR结合的肿瘤细胞提供)，这说明潜在的改进这种方法的安全性。
▲图片来源：参考来源2
目前，CAR-T细胞疗法已经发展至第四代CAR，第一代CAR的胞内结构域中只有信号转导结构域，没有共刺激域，CAR-T细胞活性差，体内存活时间短，第二代和第三代CAR分别引入了一个和两个共刺激分子，第四代CAR则还引入了促炎症细胞因子。已上市的两个CAR-T产品，Kymriah（诺华的）和Yescarta（吉利德/Kite）,都是二代CAR，Kymriah中用的是4-1BB共刺激域，Yescarta使用的CD28共刺激域，另外，此前刚刚获批的第三款CAR-T细胞Tecartus（KTE-X19，来自吉利德/Kite）与Yescarta具有相同的CAR结构。而CAR设计超越传统结构的进展将是解决目前限制并将CAR-T细胞的使用扩展到更广泛的恶性肿瘤中所必需的，各研究团队依然在积极探寻新的方向，包括同种异体CAR-T设计，可调控CAR活性的设计等等，我们期待在这一领域能有越来越多的突破。2020年8月22-23日于上海举办2020溶瘤病毒药物开发论坛（Oncolytic Virus Drug Development Forum 2020）。大会将围绕肿瘤治疗前沿技术及溶瘤病毒产品法规解读、 溶瘤病毒产业转化、溶瘤病毒项目经验分享，以及新型溶瘤病毒的发展及资本支持四个主题，专项技术深耕挖掘，为行业带来前所未有的深度技术交流及成功经验分享。
参考资料：
1.https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30883-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420308837%3Fshowall%3Dtrue
2.https://www.nature.com/articles/s41571-019-0297-y
3.https://www.medpagetoday.com/hematologyoncology/hematology/83946