精彩回顾丨免疫细胞疗法公开课第四讲，CAR-NK细胞治疗产品研发流程解析
2021年6月7日/医麦客新闻 eMedClub News/--医麦课堂携手全球科学服务的领导者Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技），在2021年第2季度上线“解码细胞免疫治疗，鼎力现在与未来”系列线上专题讲座（共四场）。
在6月3日最后一场系列公开课中， 赛默飞世尔科技生命科学事业部蛋白与细胞分析技术专家马骏带来了“CAR-NK细胞治疗产品研发流程解析”的主题课程。
马骏老师的讲座内容主要包括：
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第四场系列公开课
精彩回顾
嵌合抗原受体（CARs）技术赋予免疫效应细胞超强的抗肿瘤能力，给生物技术领域带来的前所未有的突破。除了当前炙手火热的CAR-T细胞，科学家也在不断探索多种免疫细胞类型，以达到更高的靶向性和更低的毒副作用。
CAR-NK弥补了CAR-T的多种不足：
1) NK细胞具有MHC非限制性的抗肿瘤作用，可实现“现货型”；
2) CAR-NK可以通过多种受体识别方式抑制癌细胞，灵敏度更高；
3) NK细胞不会引发移植物抗宿主病（GvHD）、细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等在CAR-T输注后常见的毒副作用；
4) 由iPSCs分化而来的CAR-NK细胞可以批量化生产，提高效率的同时，能够实现细胞治疗的标准化和成本的降低。
CAR-NK的制备一般包括以下步骤：1. CAR结构的设计、NK细胞制备；2. NK细胞的扩增、CAR转导，以制备CAR-NK；3. CAR表型鉴定和免疫分型的研究；4. CAR-NK 的扩增和功能分析；5. 建立动物模型进行临床前的体内评价。
对于人iPSC新型来源的免疫细胞，通常需要经过以下几个步骤：供体细胞的培养、重编程（即将血细胞转变为iPSC的过程）、iPSC的扩增、iPSC基因改造、分化为CAR-NK的筛选和扩增、从基因和蛋白水平进行鉴定。
接下来，马骏老师针对iPSC CAR-NK开发的关键步骤和技术进行了具体的讲解。本期课程中也罗列了一些目前已经可以用到细胞治疗当中的方法，并进行了相应的介绍。
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问答环节
1
为什么CAR-NK临床安全性比CAR-T更高？
除此之外，NK细胞与T细胞产生的细胞因子种类有着很大的不同。比如活跃的NK细胞通常产生的是IFN-γ、GM-CSF等。而CAR-T细胞通常会分泌炎性细胞因子，比如TNF-alpha，还有IL-1、IL-6等，从而会诱导细胞因子风暴的产生。因此，无论是对于CAR-T或者CAR-NK，我们都需要进行程序性的研究和各种细胞的因子检测，来观察它的临床安全性。
2
使用PrimeFlow技术进行CAR表征，从核酸水平表现出更高灵敏度，这是什么原理？这个技术还有哪些拓展应用？
马骏老师：PrimeFlow RNA分析将专利的寡核苷酸探针组设计与bDNA信号放大技术相结合，利用流式细胞术分析RNA转录本。bDNA技术提供了独特的RNA检测和信号放大方法，通过放大报告基团信号而不是靶序列（如PCR），有助于获得较PCR分析一致性更高的结果。
在PrimeFlow RNA分析中，靶点特异性的探针组包含20至40个可与目标RNA转录本杂交的寡核苷酸对。信号放大的原理是，相邻的寡核苷酸对与bDNA结构特异性地杂交，获得极佳的特异性、低背景和高信噪比。基于这样的技术，其拓展应用还包括：a)单细胞水平的基因表达异质性；b) 同一细胞中的RNA和蛋白质动力学；c)检测细胞PrimeFlow™亚群中的非编码RNA；d) 评估感染细胞中的病毒RNA；e) 抗体选择有限时分析mRNA表达水平；f)同时分析多达4种RNA转录本；g) 流式细胞术检测microRNA。总之，PrimeFlow™的技术有着非常宽广的应用前景。
3
对于CAR-NK细胞功能评价的新型技术，对比于传统技术，都各有哪些优势？
马骏老师：对于不同的细胞治疗方法，技术都在不断的发展当中。比如，PrimeFlow™可以在传统模式上来进行核酸和蛋白的共同检测，也可以进行动力学的分析。对于细胞因子检测，基于qPCR技术的ProQuantum™，其灵敏度可以比ELISA提高100倍左右。另外还有像3D模型结合荧光活细胞成像技术，也可以从接近生理状态的环境下来实现原位分析，来获得更精确的结果。
对于新型疗法，本期课程中罗列了一些目前已经可以用到细胞治疗当中的方法，并进行了相应的介绍。
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