精彩回顾丨从生产工艺和质量分析角度谈AAV基因治疗载体生产的成功之路

2021年9月19日/医麦客新闻 eMedClub News/--9月16日，医麦课堂携手宜明（北京）细胞生物科技有限公司（简称：宜明细胞）上线一场主题为“AAV基因治疗载体的大规模生产工艺和质量分析”的线上专题，宜明细胞的研发总监仲明博士，与大家了分享大规模基因载体/病毒生产制造方面的挑战和机遇，以及相关的解决方案。

仲明博士的讲座内容主要包括：

☑ AAV病毒载体的研发和生产

☑ 整个生产过程中对于质量的控制和分析

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随着近年来两款AAV药物的临床获批，许多公司开始积极的布局这个领域，目前国内AAV基因治疗产业的赛道也已铺就完备，即将迎来临床进展的新突破。宜明细胞作为一家为基因和细胞治疗提供一站式CDMA服务的企业，其质粒产品的研究和申报经验对于业内同行极具参考和学习价值。

仲明博士首先总结了GMP规范体系下的AVV的研发和生产，主要可以分为这样几个板块：

☑ 质粒的研发和生产

☑ 腺相关病毒的纯化和大规模的包装

☑ 病毒质量检测相关的检测方法学

☑ 完整的申报资料的撰写

质粒的研发和生产，包括大肠杆菌的发酵，质粒的扩增，以及两步法进行质粒的纯化。

由于质粒的扩增是在大肠杆菌中进行的，菌种库的制备以及质检尤其重要，仲明博士强调了大肠杆菌发酵工艺优化的重要性，包括接种量培养机温度pH，菌种密度控制方案等等。同时在发酵的过程中，还需要监测发酵体系并通过中控的方法来检测细菌的增殖以及质粒产量的提高。那么上游发酵完成之后，我们就进入到质粒下游的纯化工艺。

发酵的大肠杆菌经过收获，通过连续流裂解的方式进行减裂解，裂解后的菌液还要进行澄清，再通过切向流层稀进行浓缩和换液，进入两步的层析步骤。经过这些纯化程序之后得到的质粒产物，最后经过浓缩和除菌并进行灌装。

接着，仲明博士讲到腺相关病毒的包装以及下游纯化工艺，宜明细胞采用的是293的贴壁细胞或者悬浮细胞，并建立了几个相关细胞库，其中包括有完全自主产权知识产权的悬浮293xs细胞，有数据显示，293xs细胞产AVV的能力要比293f细胞要高数倍。

在细胞发酵的过程当中，同样需要进行很多参数的控制，包括转染的优化，培养基选择细胞接种的浓度，以及补料的策略等等，到了收获的时候，对细胞进行裂解和纯化主要还是用的深层过滤的工艺。

上游细胞培养的流程

为了达到GMP的要求，发酵工艺后的下游的步骤是在不同的环境的要求下进行的，倪博士以其整个生产流程工艺为例，为我们讲解了上下游的关键步骤和相关的关键质控， 详情请扫码查看直播回放。

检测方法学的开发

AUC技术（分析型超速离心技术）可以及时的检测AVV的空壳率，并且可以进行全面的方法学验证。相对于的测谱以及电镜的方法，AUC是对于空壳和离心分离度准确度最高的检测方法，它的缺点是仪器比较贵，并且测通量并不是太高，但是对于我们目前的放行的要求，同样还是能够达到标准。

除了通过AUC的检测来检测空壳率之外，宜明细胞还使用SDS-PAGE电泳检测病毒的纯度，以及使用高效液相色谱法(HPLC)用来检测相关的残留。

仲明博士说：“我们现在开始使用毛细管凝胶电泳，结合激光诱发的荧光检测方法，来检测AVV中间的残留物，我们可以看到非常微量的残留片段的大小，和相应的标准的标准品进行对照具有很好的检测线。在这个方法学的检测开发完成之后，所有相关的资料我们会进行申报资料的撰写，为客户进行药物的申报进行服务。”

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