BioRxir是由冷泉港实验室托管运营的生物学开放获取预印本的资料库，启动于2013年11月。推出这种未经同行评审的预印本分享平台的目的是降低漫长的审稿周期对学术交流效率带来的影响。经过审稿后，这些文章仍可以发表在正式杂志上，其中不乏大量高影响因子的期刊。
目前，10x Genomics上列出了59篇空间转录组相关的正式文章，只相当于单细胞测序2371篇的一个零头。由于10x Visium平台正式推出于2019年底，并处在不断升级完善的过程中，空间转录组在科研文献发表上仍处于起步阶段，此前正式发表的空间转录组经典研究论文也多次被解读转载。
基于此，我们在BioRxiv上以“10x Visium”作为关键词进行搜索，精选了以下预印本空间转录组技术相关文献，供大家参考，从中可以大致瞥见空间转录组技术的应用领域。这些文献，有的侧重于对空间转录组分析方法的开发，有的体现了空间转录组在生命科学不同领域的应用，在不久的将来，我们也会在经典的期刊中见到他们的身影。
1.Spatial charting of single cell transcriptomes in tissues（组织中单细胞转录组的空间绘图，2021.11.24，MD安德森癌症研究中心，https://doi.org/10.1101/2021.11.24.469915，空间转录组分析方法）10x Visium空间转录组平台可以揭示整张组织切片上基因表达的空间信息，但其分辨率尚不能达到单细胞精度。为了解决这个问题，一些去卷积算法可以推算不同细胞类型的比例信息，但也仅局限于芯片spot单位层面，且无法进一步地推断细胞的生物学功能及细胞轨迹转换信息等。要解决这个问题，可以在空间转录组分析中整合单细胞数据，此前的一些高分空间转录组文献也采用了这一策略，但如何更好地整合两种数据依然是一个巨大的挑战。在这篇文章中，作者开发了名为CellTrek的工具包，可以结合空间转录组与单细胞测序，定位单细胞至组织切片的相应位置。CellTrek首先基于深度学习，整合空间与单细胞数据至一个共享特征空间。利用空间数据，CellTrek可以进行多元随机森林模型（RF）训练，用以预测空间坐标信息。训练好的模型可以将整合好的空间与单细胞数据生成RF距离矩阵以衡量空间与单细胞数据的表达相似度。基于距离矩阵，CellTrek可以利用基于参数调试后的相互最邻近（MNN）算法生成spot-cell的稀疏图（Sparse Spot），最终将细胞定位至其最邻近的空间spot中去。同时，作者还开发了用于CellTrek下游分析的模块SColoc，可以实现对不同细胞类型空间关系的解析。作者对发表的小脑及肾脏数据，以及新生成的导管癌数据采用CellTrek分析，均取得了预期的理想效果。CellTrek基于R语言开发，并提供了数据可视化的图形交互式界面，完整的项目信息公布在GitHub上可供下载。（https://github.com/navinlabcode/CellTrek）
Overview of the CellTrek workflow
2.Spatial resolution of an integrated C4+CAM photosynthetic metabolism （空间分辨率下的C4+CAM整合光合代谢途径，2021.11.25， 耶鲁大学，https://doi.org/10.1101/2021.11.25.470062，植物叶片组织，植物光合作用）自基于barcode的空间转录组方法诞生以来，这项技术主要应用在动物组织上，如人和小鼠组织，而关于植物的报道则较少，仅在拟南芥、杨树等物种上有一些应用，主要受限于植物细胞中液泡与细胞壁对冻存组织及cDNA透化带来的干扰。这篇论文是时隔将近五年后，我们又一次看到空间转录组在植物上的应用，说明只要前期样品处理得当，利用10x Visium在植物中开展空间转录组研究也是没有太多障碍的。这篇文章以马齿苋叶片为研究对象，在空间层面整合了光合作用中C4及CAM（Crassulacean acid metabolism，景天酸代谢）两种不同代谢途径的细胞定位。在光合作用中，根据CO2同化的最初产物是三碳化合物（3-磷酸甘油酸）还是四碳化合物（草酰乙酸），可以将植物分为C3植物或C4植物。不同于C3植物整个卡尔文循环均在叶肉细胞中完成，C4植物的二氧化碳固定实行空间分离，叶肉细胞里的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）经PEP羧化酶的作用，与CO2结合，形成四碳的草酰乙酸，并进一步形成苹果酸或天门冬氨酸，这些四碳酸再进入叶鞘细胞中，完成卡尔文循环。此外，在仙人掌及部分景天科等植物中还存在着一种CAM途径，其产物与C4途径类似，但其CO2通过时间分离而非空间分离，即在夜间吸收CO2固定在PEP中，白天进行卡尔文循环。对于大部分植物，其光合代谢往往只涉及到上述一种途径。马齿苋是一种特殊的C4草本植物，在干旱胁迫下，亦可进行CAM。那么，马齿笕的CAM途径是仅仅局限在叶肉细胞，还是像C4途径一样，也分别在叶肉和叶鞘细胞中完成？为了回答这个问题，研究人员通过激光显微技术对不同环境（水分充足及干旱环境，白天及夜间）叶片进行切割区分，获得叶肉，叶鞘及水分贮藏细胞，进行传统的转录组分析，并结合空间转录组测序及叶片的组织区分，分析了C4及CAM相关的差异表达基因，并建立了流量平衡模型。这些数据及模型证明，在马齿苋中，C4和CAM途径与合成PEP相关的基因均在叶片中富集，而卡尔文循环相关基因只富集在叶鞘细胞中，表明马齿笕的CAM途径，不仅存在昼夜分离，也存在着空间的分离。进一步地，作者建立了双细胞-双（昼夜）阶段的光合代谢模型。当水分充足时，马齿笕叶片中只能检测到少量的CAM途径。而处于干旱环境时，可以进行C4+CAM代谢途径，此时马齿笕中的C4途径亦可利用CAM途径产生的苹果酸，大幅提高光合作用的效率。这一发现，对干旱环境下的作物改良，保证全球粮食安全，具有重大而深远的意义。
空间转录组分析不同叶片成分中C4、CAM及卡尔文循环相关基因的差异表达
3.A spatial multi-omics atlas of the human lung reveals a novel immune cell survival niche（空间多组学人类肺细胞图谱揭示免疫细胞生存微环境，2021.11.26，英国桑格研究所，https://doi.org/10.1101/2021.11.26.470108，人类肺/气道组织，细胞图谱，免疫学）细胞图谱是单细胞技术应用的一大经典方向，而空间转录组结合单细胞数据，将极大扩充细胞图谱类文章的内容，尤其是一些新细胞类型的鉴定。在这篇文章中，作者利用多组学数据，包括单细胞测序及细胞核测序，VDJ免疫库组测序，空间转录组测序，对来自五个不同位置的人类肺及气道组织进行分析，以期定义肺的组织微环境。文章定义了一些新的细胞类型及细胞状态，并通过空间组学重新将它们定位回组织中，包括成人肺软骨细胞，粘膜下腺体（SMG）导管细胞，外膜细胞与平滑肌细胞的新亚型，免疫招募纤维细胞，支气管与软骨膜细胞等。作者还定义了SMG上分泌免疫球蛋白A的浆细胞的生存微环境，这一环境涉及新定义的上皮SMG导管细胞，以及T细胞和B细胞。最后，文章给出了基于转录组学的细胞互作图谱，并提出了支持这一微环境的信号通路。
空间多组学数据分析人类肺组织不同细胞类型及空间定位
4.Spatiotemporal transcriptomics reveals pathogenesis of viral myocarditis （空间转录组揭示病毒性心肌炎发病进程，2021.12.07，康奈尔大学， https://doi.org/10.1101/2021.12.07.471659，小鼠心脏和肠组织，传染病学/免疫学）空间转录组在分析传染病发病进程中具有重要的应用价值。文章采用新生小鼠作为研究对象，通过口服呼肠病毒使其感染心肌炎，对不同时间点的回肠及心脏组织进行了单细胞和空间转录组测序，用以研究何种细胞会受到感染，以及感染进程中细胞和空间的异质性，以及先天性和适应性免疫反应。研究表明，在口服接种后，病毒首先在一天内感染肠内分泌细胞以及上皮细胞，这些细胞会产生强烈的先天免疫反应用以阻止病毒的复制。四天内，病毒会感染肠道的淋巴细胞，通过淋巴引流途径，病毒可以通过血液循环传染到第二感染点，这其中就包括心脏。大约四天后，病毒会感染心脏血管内皮细胞，内皮细胞也会激发强烈先天免疫反应。在表现出症状的小鼠中，产生炎症反应的内皮细胞会分泌趋化因子招募免疫细胞，包括细胞毒性T细胞。组织浸润的细胞毒性T细胞会诱导心肌炎组织的细胞死亡。这些发现，揭示了心肌炎感染发病的动态进程，以及不同细胞表型的空间异质性网络和与病毒诱导相关的细胞间互作。
呼肠病毒感染小鼠心脏及回肠组织的单细胞与空间转录组分析
5.Recurrence of cancer cell states across diverse tumors and their interactions with the microenvironment （多种复发性肿瘤组织细胞状态与肿瘤微环境互作，2021.12.20，纽约大学， https://doi.org/10.1101/2021.12.20.473565，多种癌组织，癌症生物学）这篇文章来自纽约大学Itai Yanai研究组，此前提出MIA方法的胰腺导管癌的NBT空间转录组正是出自这一实验室。文章探讨了一个宏大的主题：肿瘤微环境。此前在单个癌症类型的单细胞水平上对肿瘤分析将转录异质性表征成不同的细胞状态，揭示了多样的细胞状态可能代表稳定的功能性单元，在肿瘤维持与发展中起补偿作用。尽管如此，目前尚不清楚这些状态在多大程度上跨越了肿瘤类型来体现癌症的一般特征。此外，癌细胞状态在肿瘤进展中的作用及其与肿瘤微环境细胞的特定相互作用仍有待阐明。这篇文章对15种不同的癌组织进行了泛肿瘤单细胞转录组分析，鉴定了16个不同的基因表达模块，定义了复发性癌细胞的多种状态，包括压力状态，干扰素响应，上皮细胞-间叶细胞转换等。利用小鼠模型，研究发现干扰素响应模块的诱导因肿瘤位置而异，这一模块会因淋巴消除而减弱。空间转录组分析进一步地将癌细胞中的干扰素响应与肿瘤微环境中的T细胞及巨噬细胞联系起来。这项研究为研究癌细胞状态与肿瘤微环境的互作提供了基本的框架。
6.Spatiotemporal dynamics of molecular expression pattern and intercellular interactions in glial scar responding to spinal cord injury （脊髓损伤中胶质瘢痕的时空动态、表达模式与细胞间互作，2021.12.20，南通大学， https://doi.org/10.1101/2021.12.20.473346, 小鼠脊髓组织，损伤医学/组织修复）国内运用空间转录组进行分析的文章也有后来居上之势。这是一篇来自南通大学顾晓松院士组关于脊髓损伤后胶质瘢痕中分子表达模式和细胞间互作分析的文章。成年哺乳动物的脊髓损伤后，再生功能较差，但新生哺乳动物和一些脊椎动物如鱼和蝾螈的脊髓则具有较好的再生能力。研究表明，神经外源因子--胶质瘢痕与损伤修复密切相关，但这种关联性是促进还是抑制依然是非常模糊的。这篇文章以小鼠脊髓组织为研究对象，结合空间转录组数据与单细胞数据对这一问题进行了探讨。研究给出了脊髓损伤后胶质瘢痕形成过程的完整细胞表达图谱，揭示了细胞状态轨迹转换及空间异质性。利用空间转录组技术，作者给出了胶质瘢痕的成分分析。活化的星形胶质细胞和小胶质细胞围绕着纤维化疤痕的外层。非神经细胞，包括局部和浸润的免疫细胞和成纤维细胞，聚集在瘢痕的核心。活化的少突胶质细胞包围外层并参与免疫稳态。即使是瘢痕驻留的少突胶质细胞也能通过分泌的神经毒素阻碍轴突延伸。空间转录组数据还揭示了脊髓损伤后的单核细胞可能来自邻近的颅骨和脊柱骨髓，这与之前的认识不同。同时，研究还表明大多数瘢痕驻留巨噬细胞来自相邻的颅骨。研究还揭示了脊髓损伤修复的空间动态。目前对胶质瘢痕的普遍看法是它同时具有有害特性和有益特性，既能抑制轴突再生，也能保护剩余的神经组织，但对这些功能的时间和空间特性知之甚少。尽管瘢痕驻留成纤维细胞在中间阶段阻碍轴突延伸，但它们分泌 Bmp7 以支持瘢痕驻留少突胶质细胞的存活。在胶质增生和纤维化过程中，细胞簇边界上的双向配体-受体相互作用有助于维持疤痕结构。细胞在瘢痕中位置的时空变化可能与其功能有关。脊髓损伤后，新生的小胶质细胞亚群可以在两个残余成分间形成桥梁并介导轴突再生。通过空间转录组分析，还发现成熟小胶质细胞的一个特殊亚群可以穿过纤维化瘢痕并建立连接。但这些桥梁最终在28天后时消失，说明不同发育阶段再生能力的差异与瘢痕微环境密切相关。研究还发现骨髓来源的单核巨噬细胞也可能参与了修复的过程。这些发现都对脊柱损伤修复具有重要的临床指导意义。
7.A spatiotemporal steroidogenic regulatory network in human fetal adrenal glands and gonads.（人类肾上腺与性腺中类固醇调控的时空网络，2021.12.22, 广西医科大学，https://doi.org/10.1101/2021.12.22.473776，人类胎儿肾上腺和性腺组织，发育生物学）又是一篇来自国内机构的文章，来自广西医科大学莫曾南教授研究组。这篇文章将空间转录组用于发育生物学的研究，探讨了胎儿肾上腺影响生殖腺发育进而决定性别分化的过程。人体中肾上腺分泌的脱氢表雄酮（DEHA）是性激素的重要前体，但是这其中的生物学机制不甚明晰。为了解决这个问题，文中对孕7周到孕14周的肾上腺和性腺进行了单细胞转录组测序，结合空间转录组重现了单细胞的空间位置信息。同时还对性别分化期（孕8周至孕12周）的内层类固醇生成细胞进行了多组学测序（COOL-seq）。利用这些数据，研究发现类固醇生成细胞和其他非固醇类细胞促进了肾上腺皮质的形态建成。在性别分化的关键窗口期，关键性酶基因的表达发生了改变，加速了雄性个体中DHEA的合成，而在雌性个体中，这些基因的表达改变则促进了皮质醇的合成。研究还发现肾上腺和睾丸中SST基因的高表达放大了男性胎儿雄性激素的表达。这项研究加深了对人类胎儿性别分化复杂调控机制的理解。
8.Neurons burdened by DNA double strand breaks incite microglia activation through antiviral-like signaling in neurodegeneration.（神经退行性变化中神经元DNA双链断裂通过类抗病毒信号激活小神经胶质，2021.12.23，麻省理工学院， https://doi.org/10.1101/2021.12.23.474002, 人和小鼠脑组织，神经生物学）脑组织由于其复杂的结构分区也一直是空间转录组的热点应用方向。这篇文章聚焦神经细胞的衰老进程与神经退行性疾病，研究年龄相关的DNA双链断裂（DSB）在神经元中的积累对神经系统的影响。通过对小鼠模型和阿尔兹海默症（AD）患者进行细胞核测序及空间转录组测序，研究发现带有DSB的神经元进入了以衰老激活和类病毒免疫通路为标志的晚期DNA损伤应答状态。研究还鉴定了NFκB转录因子是出现DSB的神经元中免疫相关基因表达的主要调控元件，细胞因子如Cxcl10和Ccl2在带有的DSB神经元中的出现早于神经胶质细胞。AD与兴奋性神经元中的免疫激发显著相关，从AD患者脑组织中提取的带有DSB的神经元进一步证实了免疫基因上调现象。基因空间表达信息表明，带有DSB的神经元富集区域含有丰富的炎症小神经胶质细胞，在NFκB敲除的神经元中可以缓解这样的富集。在带有DSB的神经元中抑制NFκB或敲降Ccl2及Cxcl10细胞因子也可以在脑切片组织培养中降低小神经胶质细胞的激活。总的来说，研究揭示了在与年龄相关的神经退行性疾病中，DSB激活神经元中的免疫通路，神经元则产生衰老相关的分泌表型促进小神经胶质细胞的激活。
由于10x Visium平台尚不能达到单细胞分辨率，因此将单细胞-空间转录组联合分析是应用这项技术的主流手段，如这项技术推出的初衷一样，空间转录组解决了因单细胞测序解离步骤带来的空间信息缺失，能得到更全面的细胞图谱信息，进而在空间层面分析互作及动态进程。这些文章也体现了空间转录组广泛的应用方向，不仅包括早先三足鼎立的癌症生物学、神经科学及发育生物学，还包括损伤医学、传染病学、免疫学以及植物上的应用。据不完全统计，2021年11月和12月，在bioRxir空间转录组相关研究文献已经上线30篇，几乎与2021年全年正式发表的空间转录组文章总量持平，相信还有不少未发表在预印本上处于审稿进程中的文章。作为风口上的新技术，2022年注定是空间转录组文献井喷式爆发的一年。好风祝君上青天，你，不打算凭风而起，扶摇直上九万里吗？