中石大徐海课题组/曼彻斯特大学吕建仁课题组JACS新作：基于D/L-氨基酸交替排列的α-sheet寡肽自组装

▲第一作者：周鹏        

通讯作者：吕建仁教授，徐海教授  

通讯单位：中国石油大学（华东），曼彻斯特大学 

论文DOI：10.1021/jacs.2c08425   

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全文速览

在该项工作中，我们利用不同氨基酸的构象倾向，设计了L-和D-氨基酸残基交替排列的类表面活性剂自组装寡肽，通过实验研究（小角中子散射（SANS）、透射电子显微镜（TEM）、X-射线衍射（XRD）、圆二色光谱（CD）等）和副本交换分子动力学（REMD）模拟相结合，证明所设计寡肽分子易于形成α-sheet这种较为罕见的二级结构，并以此为基础进一步组装成高度有序的纳米管状结构。

02
背景介绍

A.自组装肽的二级结构

众所周知，α-helix和β-sheet是多肽和蛋白质分子折叠过程中常见的两种二级结构。根据所形成的二级结构，自组装肽（self-assembling peptides, SAPs）大体可分为两类，即α-helix和β-sheet（包括β-hairpin）自组装肽。基于β-sheet的SAPs序列一般较短，组装体通常具有典型的cross-β结构特征，β-sheet与组装体的纵轴（长度方向）大体平行，肽骨架（strand）几乎垂直于该轴。由于难以精确控制β-sheet侧向排列的数量和β-sheet扭曲程度，使得富含β-sheet的组装体通常在其形态上表现出高度多态性（polymorphism），类似于淀粉样原纤维。基于α-helix的SAPs通常具有较长序列并形成3.6₁₃ helix，为了实现更高阶的自组装，必须将特殊的结构组件（structural motif）（如coiled-coil的粘性末端、精氨酸扣等）插入序列内的特定位置。除了这两种常规的二级结构外，还有一些不常见的二级结构类型，如3.0₁₀ helix、π helix和α-sheet。与3.6₁₃ helix和β-sheet相比，它们的稳定性比较低，因此它们在天然蛋白质中不太常见，甚至罕见，长期以来一直被视为蛋白质折叠中的瞬时构象或中间体。但是，极有可能从这些不常见二级结构衍生出具有独特性质的新型超分子结构和材料，开创新的多肽自组装研究领域。到目前为止，基于这些不常见的二级结构来构建有序组装体仍然是一个具有挑战性的研究课题。

B.α-sheet 二级结构

在淀粉样蛋白和Aβ肽的分子模拟研究中，研究人员预测到可能存在α-sheet二级结构，并指出它们可能是神经退行疾病中的毒性构象。实际上，α-sheet二级结构最初是由Pauling和Corey在1951年提出，但由于在天然蛋白中罕见而被长期忽略。与β-sheet二级结构类似，α-sheet肽主链也是呈现伸展构象，但其残基是α^L和α^R 螺旋构象交替排列，且主链C═O（δ-）或NH（δ+）基团具有相同的取向，类似于α-helix。鉴于L-和D-氨基酸对α^L和α^R构象的相对偏好，在人工设计的肽序列中L-和D-氨基酸残基的交替有助于α-sheet的形成。然而，在肽自组装领域，已报道的具有L-和D-氨基酸交替排列的短肽分子要么可以自组装形成纳米纤维，但采取β-sheet二级结构，要么丧失自组装能力，形成无规则卷曲结构。迄今为止，还未见有基于α-sheet二级结构肽自组装体系的报道。

03
本文亮点

提出基于α-sheet自组装寡肽的设计原则，在L-和D-氨基酸残基交替排列的基础上，充分利用不同氨基酸的构象倾向，特别是亮氨酸（Leu或L）倾向形成helix构象，以及类表面活性剂短肽的结构特征和组装规律，设计了Ac-L^DLL^DLK-NH₂ and Ac-^DLL^DLL^DK-NH₂，综合运用实验和模拟相结合的方法，证实了α-sheet结构的形成，并阐明从单分子到组装体的结构依赖关系。

04
图文解析

▲图1 肽分子中的氨基酸残基构象倾向。（a）单体、（b）二聚体和（c）三聚体REMD模拟中Ac-L^DLL^DLK-NH₂残基的Ramachandran图。

Ac-L^DLL^DLK-NH₂的REMD模拟结果显示：Ac-L^DLL^DLK-NH₂单体分子模拟中，L-Leu1和L-Leu3的α^R构象占主导地位。与Ac-LLLLK-NH₂的Leu残基相比，这两个残基在Ramachandran图表现出更多的β/extended构象（图1a）。D-Leu2和D-Leu4的二面角分布总体上与L-Leu1和L-Leu3相似，但处于Ramachandran图中的轴对称象限。从单体到三聚体，四个Leu残基的β/extended构象逐渐减少，L-Leu和D-Leu残基分别收敛为α^R和α^L构象的趋势越发显著（图1b，c）。

▲图2 肽分子构象和分子间排列方式。Ac-L^DLL^DLK-NH₂单体、二聚体和三聚体的REMD模拟结果：（a） 以分子首尾距离和分子内氢键数为坐标的Ac-L^DLL^DLK-NH₂单体的自由能面。（b） 以接触度和分子间氢键数为坐标的Ac-L^DLL^DLK-NH₂二聚体的自由能面。（c） 以相邻分子接触度为坐标的Ac-L^DLL^DLK-NH₂三聚体的自由能面。代表性单体（结构I和II）、二聚体（结构III和IV）和三聚体（结构V–VII）在自由能面的顶部和底部分别给出，分子间氢键由虚线表示。

当L型和D型氨基酸残基交替出现在序列中时，整个Ac-L^DLL^DLK-NH₂分子主链倾向于呈现伸展状态（图2a中的结构I）。从单体到三聚体，首尾距离越来越长。在二聚体模拟中，分子形成平行和反平行排列的概率相当（图2b）。需要注意的是，二聚体中相邻残基的羰基氧原子（氢键受体），倾向于排列在主链的一侧，而它们的酰胺氢原子（氢键供体）则位于另一侧。因此，生成的链间氢键模式与典型β-sheet二级结构中的氢键模式非常不同：其中残基i的羰基氧和酰胺氢原子位于链的一侧，相邻残基i+1和i–1的氢键位于相反侧。在三聚体模拟中，存在六种类型的分子间排列方式，包括没有分子间氢键的聚集体、平行和反平行二聚体，以及平行（结构VI）、反平行（结构VII）和混合平行/反平行（（结构V）三聚体（图2c）。平行和反平行排列中，几乎所有的C═O基团排列在主链的一侧，而N–H基团在另一侧，即主链C═O（δ-）或NH（δ+）基团具有相同的取向，类似于α-helix。此外，由于侧链交替指向相反的方向，避免了潜在的空间拥挤,有利于高级组装体的形成和生长。

▲图3自组装纳米结构和分子间排列的实验表征。（a）浓度为16 mM的Ac-LLLLK-NH₂、（b）Ac-L^DLL^DLK-NH₂和（c）Ac-^DLL^DLL^DK-NH₂组装体的cryo-TEM照片。（d）Ac-LLLLK-NH2、（e）Ac-L^DLL^DLK-NH₂和（f）Ac-^DLL^DLL^DK-NH₂的SANS数据和拟合曲线。（g） 浓度为16 mM的Ac-LLLLK-NH2、Ac-L^DLL^DLK-NH₂和Ac-^DLL^DLL^DK-NH₂的CD光谱,（h）粉末XRD图,（c） ThT的荧光发射光谱（在442 nm处激发）。

通过TEM和SANS表征（图3（a）-（f）），我们证明两种混合手性氨基酸肽分子自组装形成纳米管和螺旋纳米带，不同于单一手性氨基酸肽分子Ac-LLLLK-NH₂形成的扭转纳米纤维。进一步的结构表征显示，这些自组装结构具有与β-sheet类似的光谱信号，且具有更高水平的分子排列有序性(图3（h）和（i）)。

▲图4. 基于α-sheet二级结构的Ac-L^DLL^DLK-NH₂自组装纳米管的结构模型。（a） Ac-L^DLL^DLK-NH₂的α-strand分子构象。（b） strand间和sheet间分子排列方式和分子层曲率。（c） 基于实验和模拟结果推测的一种可能的混合平行/平行α-sheet排列方式。（d） Ac-L^DLL^DLK-NH₂纳米管结构及其中的分子间排列。

基于实验表征，结合REMD模拟结果，我们推测Ac-L^DLL^DLK-NH₂纳米管的形成机制是基于α-sheet混合平行/反平行分子排列方式（图4）。REMD模拟显示，Ac-L^DLL^DLK-NH₂的残基构象、分子间排列方式，分子骨架间氢键模式与α-sheet的模式一致，只有通过这种不寻常的二级结构，Ac-L^DLL^DLK-NH₂才能进行分级自组装，形成纳米管而不是纳米纤维。基于α-sheet聚集体的模拟结果计算的CD光谱与实验光谱一致（图3（g）），有力地支持了形成α-sheet二级结构这一推论。

05
总结与展望

多肽自组装不仅在生命体系中普遍存在，同时也是合成纳米生物材料的有效手段之一。多肽自组装过程通常是一个分级组装过程，初始阶段基于肽链氢键所形成的二级结构在组装体的结构有序性和性能方面发挥着决定性作用。尽管一些不常见二级结构很有可能导致新颖超分子结构的形成和特殊性能的产生，但基于它们构建有序肽组装体仍然非常具有挑战性。α-sheet二级结构，最早由Pauling和Corey先于β-sheet提出，然而到目前为止，还未见有基于α-sheet构筑自组装结构的报道。

在这项工作中，我们报告了一种基于α-sheet新型肽自组装体系的设计。通过主链中L-和D-型氨基酸残基的交替，并利用亮氨酸强的螺旋构象倾向，设计了类表面活性剂自组装肽Ac-L^DLL^DLK-NH₂和Ac-^DLL^DLL^DK-NH₂。通过实验和模拟相结合的研究方法，排除了β-sheet二级结构形成的可能性，并分析了α-sheet二级结构和α-sheet纳米管的形成机制和过程。由于α-sheet为极性sheet，基于该二级结构构筑的有序组装体可能具有不同于β-sheet组装体的特殊性质。这项研究和相应的肽设计策略对今后设计和开发新型肽自组装体系具有重要的指导意义。

06
参考文献

Zhou, P., Hu, X., Li, J., Wang, Y., Yu, H., Chen, Z., Wang, D., Zhao, Y., King, S.M., Rogers, S.E., Wang, J., Lu, J.R., and Xu, H., Peptide self-assemblies from unusual α-sheet conformations based on alternation of D/L amino acids. J. Am. Chem. Soc., 2022, in press.

Pauling, L.; Corey, R. B. The Pleated Sheet, a New Layer Configuration of Polypeptide Chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1951, 37, 251-256.

Wang, M., Zhou, P., Wang, J., Zhao, Y., Ma, H., Lu, J.R. and Xu, H., Left or right: How does amino acid chirality affect the handedness of nanostructures self-assembled from short amphiphilic peptides? J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 4185-4194.

Zhou, P., Wang, J., Wang, M., Hou, J., Lu, J.R. and Xu, H., Amino acid conformations control the morphological and chiral features of the self-assembled peptide nanostructures: Young investigators perspective. J. Colloid Interface Sci., 2019, 548, 244-254.

Zhou, P., Deng, L., Wang, Y., Lu, J.R. and Xu, H., Interplay between intrinsic conformational propensities and intermolecular interactions in the self-assembly of short surfactant-like peptides composed of leucine/isoleucine. Langmuir, 2016, 32, 4662-4672.

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课题组介绍

课题组网站：

https://www.x-mol.com/groups/jiqian

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