PROTAC胞内自组装提高降解蛋白效率

▉  原文信息

▉  作者简介

今天给大家带来一篇发表在ACS Cent. Sci (IF= 12.837)的文章，本文的通讯作者是来自英国剑桥Astex药物公司的Tom Heightman，他同时也是英国皇家化学会的成员。他的研究领域横跨药物发现的各个方面。图源自参考资料1

▉  导读

本文作者Phm君近日苦心研究该领域的文章，颇有心得的他给大家带来一篇几年前发表的文章，虽然不是最新的进展，但是idea是值得大家学习的。顺便给大家恶补一下该领域的一些基础知识，尤其是药化的同学，以后可别说没听过下面这么火热的技术（小心导师鄙视的眼神）。言归正传：

1. 蛋白质翻译后修饰中，泛素化修饰起着重要的调控作用。在细胞中各种E3泛素连接酶会催化特定蛋白质的多泛素化修饰，使得该蛋白质在蛋白酶体中被降解，这也是细胞中蛋白质被降解的主要方式。

2. PROTAC (proteolysis targeting chimeras) 是一个两头含有不同配体的化学分子，一头是结合E3连接酶的配体（上图粉色三角），另一头是结合细胞内蛋白质（上图TP：target protein）的配体（上图黄色圆圈），这两个配体再由一段linker连接起来。这样的化学分子既可以结合E3泛素连接酶，又可以结合胞内蛋白质，通过把靶向的蛋白质招募到E3泛素连接酶附近来实现靶向蛋白质的多泛素化（上图黄色糖葫芦），最后被蛋白酶体降解（上图黄色圆柱）。PROTAC可以循环使用，不被蛋白酶体降解。图源自参考资料2

3. PROTAC为药物研发领域提供了全新的方法，与普通的小分子抑制剂不同，PROTAC的配体设计只需要能与靶向蛋白结合即可，并不需要竞争抑制，这使得一些在以前认为的“undruggable”的靶点如结构蛋白、转录因子也可以成为小分子药物的靶点，只需要使用能结合该类蛋白质的配体做成PROTAC即可。PROTAC 作为药物有很大的优势，对于PROTAC而言，往往不需要高亲和性的配体，只要能引起E3与相应蛋白的相互作用即可。

▉  前言

1. 然而第一个PROTAC使用的配体并不是化学小分子，而是特定E3的天然底物—特定序列的多肽，这使得PROTAC难以进入细胞。即使在后续的PROTAC中两头的配体都换成了化学分子，由于PROTAC本身较大的分子量和大量的极性分子面，PROTAC仍然不能很好地穿透细胞，水溶性也较差，这使得PROTAC难以成为有效的药物。

2. 在本文中作者创造性地利用了四嗪与反式环辛烯的快速点击反应。使得PROTAC的两头配体在进入细胞前并不由linker相连，待到它们进入细胞后再利用这一正交反应将它们连起来。这样的分裂配体的技巧不仅可以减小分子量，增大其水溶性和细胞穿透性，还可以通过使用不同的分裂配体来实现不同靶向蛋白的降解。这样的PROTAC被称为CLIPTAC (in-cell click-formed proteolysis targeting chimeras)，而相应的分裂配体为CLIPTAC前体。需要注意的是，这样的CLIPTAC前体在细胞外仍可以发生正交反应而连接起来。之所以能控制在胞内连接是由于先加入其中一种CLIPTAC前体，待到其大部分进入细胞时再加入另一种能与它发生正交反应连接的CLIPTAC前体。图中CRBN为E3酶。BRD4与ERK1/2为重要的肿瘤治疗靶点蛋白。

▉ 内容

a| CLIPTAC的设计与合成

设计的难点主要在于linker的长度和连接的位置。Linker过长会使得降解的效率大大降低，而较短以及连接位置不合适又可能引起四嗪或者反式环辛烯对于配体-蛋白结合的干扰，也会干扰正交反应的进行造成无法连接的后果。通过查阅之前文献发展的降解BRD4的PROTACs的linker数据，以及本文作者自己对最终结果的理论模拟计算，最后设计出了与CRBN结合的CLIPTAC前体-四嗪连接的Tz-thalidomide(1)，以及与BRD4结合的CLIPTAC前体-JQ1-TCO(2)。两个前体通过正交反应最终生成了JQ1-CLIPTAC(3)。

b| JQ1-TCO(2)和JQ1-CLIPTAC(3)对BRD4的相互作用以及CLIPTAC对BRD4的降解实验

作者首先在体外的溶液中证明了两个前体可以发生正交反应生成JQ1-CLIPTAC(3)，然后通过实验验证了JQ1-TCO以及JQ1-CLIPTAC对于 BRD4 有着相似的强的亲和力（图示a）。

作者在使用CLIPTAC时选择先加入JQ1-TCO再加入Tz-thalidomide，通过一系列的细胞水平探究实验发现CLIPTAC对于BRD4的降解是依赖浓度与时间的。同时为了验证CLIPTAC按照本文所推测的机理发挥降解BRD4的作用，作者采用了一系列的阴性对照试验。包括使用不能发生正交反应的前体以及蛋白酶体抑制剂，最后证实了CLIPTAC是根据所推测的机理发挥降解BRD4的作用。（图示b,c）

c| CLIPTAC对ERK1/2的降解

（图示a）在证实了CLIPTAC方法的可行性以后，作者想把此方法扩大到其他蛋白质的降解上。于是作者选择了前人没有做过的对于ERK1/2（一种激酶）使用 PROTAC的靶向降解，想直接将CLIPTAC应用在ERK1/2的降解上。使用了作者之前设计的针对ERK1/2共价连接的反式环辛烯标记的抑制剂Probe 1(5)。

（图示e）通过之前的类似的实验最后作者确定了该CLIPTAC的降解效果：如图红色框内，加入Probe 1(5)以及TZ-Thalidomide时效果显著，当加入carfilzomib（蛋白酶抑制剂）时降解效率较低。

d| CLIPTAC的优势

看到这里有的同学肯定会问那如果把这两个组会先在体外混合后再加入，到底会不会有效果？别急，作者已经做了。胞外已经连接好的CLIPTAC（6结构见原文）与细胞共同培养18h，发现BRD4以及ERK1/2在细胞内的浓度没有明显变化。这是由于连接好的CLIPTAC对于细胞膜的穿透能力十分弱，所以直接使用这样的CLIPTAC是无法实现有效的靶向蛋白降解。

▉ 亮点总结

本文的最大亮点就是解决了普通的PROTAC进细胞困难的问题，在之前想靠引入易于穿透细胞膜的基团或者特殊的多肽序列来克服这一难题，效果不仅不够好，而且也不是一种general的方法。本文凭借四嗪与TCO的正交反应几乎完美地解决了这一问题，使得PROTAC有望能够成为真正的有效药物。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acscentsci.6b00280 

参考资料

1. http://www.chemicalprobes.org/tom-d-heightman

2. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmedchemlett.9b00597

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作者：Phm.      编辑：Forever.

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