JACS：光激活选择调控--加速转录组重组研究

▉  原文信息

▉  作者简介

今天给大家带来一篇最近发表在 J.Am.Chem.Soc (IF=14.695) 上面的文章。文章的通讯作者是来自多特蒙德工业大学化学和化学生物学学院的Daniel Summerer教授。他主要的研究的领域是通过探针以及各种效应分子去探究表观遗传。图片来源于参考资料1

▉  前言

1.胞嘧啶（C）的甲基化修饰是一种重要的DNA表观修饰，TET（Ten-eleven-translocation）家族蛋白可催化5-甲基胞嘧啶（5mC）的氧化使其转变为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）、5-羧基胞嘧啶（5caC），三种核酸碱基中间体进而实现DNA的去甲基化（C）。其中这三种中间体也会与关键核蛋白发生特异性相互作用并影响核小体的稳定性和定位，进而重塑表观基因组和转录组。

2.然而，许多疾病都是因为TET错误突变干扰胞嘧啶正常氧化而发生的，比如TET2突变引发造血系统恶性肿瘤，因此想要研究特定的TET2突变体对其催化动力学的影响，需要有一种能在特定时间点选择性激活TET的手段。目前有几种办法进行调控研究：

• Tet on/off系统调控蛋白表达
• siRNA敲除表达该蛋白的基因
• 通过TET效应小分子实现调控

但是这几种方法局限在于仅仅可在特定活性位点进行抑制，并且各种体内同源TET共存，因此在特定时间点，选择性的在某一位点激活特定TET活性面临巨大挑战。

3.本文利用基因密码子拓展技术，通过基因修饰，在TET2上定点插入4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-L-serine（图b，1），该非天然氨基酸是受光调控的。在没有光照时，caging group会阻碍TET蛋白与辅因子结合及催化的过程；当有光照时，caging group脱离，重新恢复此位置原来的氨基酸，TET活化。进而研究TET2突变体对体内催化的影响及其体内催化动力学。

▉ 内容

a| 筛选1的最佳丝氨酸/苏氨酸活性取代位点，以及表达蛋白效率

作者以小鼠的mTET2基因序列为模版设计表达质粒，使其C末端带有HA-tag，并分别在上述活性位点替换琥珀密码子（非天然氨基酸插入的位置）。通过上图TET共晶结构，选择三个可能影响其与底物结合的位置，并且验证了细胞内通读表达的效率，分别通过抗HA免疫染色及流式细胞仪测定mTET2的表达，发现加入非天然氨基酸（1）条件下S1812位点表达效率较高，同时不加非天然氨基酸的背景最低。

b| 验证TET2突变体的光激活效率

当5mC氧化为5hmC时即可证明mTET2从非活性形式转变为活性形式：通过光照射与否培养，用抗HA和抗5hmC免疫共染色成像。三个不同位点突变的小鼠mTET2的细胞在只有光照后才显示有高的5hmC形成（图中绿色），证明了方法的可行性。

c|人hTET2突变体的光激活效率验证

使用同样的方法在人hTETs(hTET1, hTET2和hTET3)活性位点插入1（活性位点参照上述鼠源mTET2_S1812），验证在其S1898插入1调控hTET2的效果最好。由于TET2是造血系统恶性肿瘤中最常见的突变基因之一，他们以此为工具通过对不同的关键位点突变，研究TET2催化动力学效率。如图b为hTET2_wt活性位点的晶体结构，图c为在予/不予光的情况下hTET2 的各种突变体（其中，S1898位点已经引入非天然氨基酸1）催化5mC形成5hmC的效率。（简单讲就是蛋白1812丝氨酸位点被这个能光学脱笼的非天然氨基酸取代，这个时候去突变一些1812旁边一些关键的位点，再进行光照，1812位点的那个非天然氨基酸光保护基团被脱掉，得到了1812位点本来的丝氨酸，这个时候就能研究突变之后对TET催化动力学的效率问题）。

d| 选择性调控hTET2催化引发的转录激活动力学

在hTET2的S1898位点插入1光激活后测量TET2目标基因ARC的mRNA水平，发现hTET2触发了mRNA的表达上调（图a）并且呈现线性上调增长（图b）。然后进一步实现了时间分辨（图c,4h和8h）的监控靶基因激活和转录组重组，并观察TET2动态调节染色质基因以及mRNA转录进程。

▉ 亮点总结

本文所介绍的光介导的非天然氨基酸的策略使得TET2的选择性激活成为了可能，并能够在时空上的精确控制TET2的表达及其在体内研究其的催化动力学，为TET催化引发的相关事件的动力学研究奠定了基础。

原文引用：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.0c01193

参考资料：1.http://www.ccb.tudortmund.de/fb03/de/Fachbereich/NF_Archiv/2016/NF148/index.html

往期精彩

作者：yyt.      编辑：Forever.

北京大学医学部博士在读，微信(id:xs2014233)。目前已经有近400人药学交流群（好学，有趣且奔波于药学圈人才聚集于此）。进群加作者微信或者扫描二维码添加作者，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。

文中图片、封面图片来自Pixabay，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系药学速览。

原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。

有问题可发邮件至[e-mail]获取更多信息。

©2020 药学速览 保留所有权利