mRNA疫苗"火了"，DNA疫苗还会远吗？

▉ 导读

辉瑞和Moderna COVID-19 mRNA疫苗上市，极大程度上推动了核酸疫苗的发展。核酸疫苗与传统疫苗相比，具有诸多优势，如设计简单、生产迅速、易于运输和储存，尤其适合应对突发性感染性疾病。由于核酸疫苗编码蛋白质抗原在宿主体内合成，可实现天然翻译后修饰，如磷酸化、糖基化等，提高免疫效果。当前，核酸疫苗开展的临床试验主要集中在癌症、自身免疫病和感染性疾病领域。

核酸疫苗的应用领域

▉ DNA疫苗设计与组成

DNA疫苗一般采取质粒形式（pDNA），包括转录单位和制备单位。转录单位包含病毒杂合或真核启动子、内含子、目的基因以及polyA信号区。与mRNA疫苗相比，DNA疫苗性质更加稳定，而mRNA疫苗无需入核即可实现蛋白翻译，避免插入突变。

启动子负责与RNA聚合酶连接，控制质粒转录，并最终实现翻译。通常使用CMV启动子，其可在各种细胞系中实现高水平抗原表达。然而，病毒启动子会在基因沉默作用下迅速失活，导致短暂基因表达。因此，采用病毒-哺乳动物杂合启动子，在体内、体外延迟启动子失活。一般，内含子序列位于启动子和目的基因之间，可有效提高抗原表达。polyA信号区可稳定mRNA转录，促进其从胞核释放。

制备单位包括复制起始序列和抗生素抗性基因。前者使质粒在宿主体内实现扩增，后者使质粒可在菌落中进行筛选。体内试验中，法规强烈禁止抗生素抗性基因使用，以防止病人产生抗生素抗性和抗性基因的人类基因组整合。

DNA疫苗的设计单元▉ DNA疫苗的作用机制

DNA疫苗在注射位点转染细胞，经过内化和转位作用到达胞核，实现抗原表达，最终抗原通过细胞凋亡或外泌体形式排出细胞。抗原提呈细胞（APC，包括树突状细胞DC、巨噬细胞和B细胞，具体知识请参考人人读懂免疫学第十五期）,这里以DC为例。DC捕获该抗原（外源抗原）后从组织进入淋巴结，捕获抗原在DC内体溶酶体作用下降解为多肽，随即以MHC II-抗原肽形式展现于DC表面，在淋巴结内提呈给CD4+T细胞。CD4+T细胞进一步引发B细胞反应，同时活化CD8+T细胞。外源抗原也可通过感染细胞MHC I分子途径提呈给CD8+T细胞。

此外，DCs也可直接被DNA疫苗转染，抗原在DCs中表达，由于DCs既可表达MHC I，也可表达MHC II，因此DCs可同时活化CD4+T细胞和CD8+T细胞。活化CD4+T细胞和CD8+T细胞在IL-2（自分泌）作用下，实现扩增，分别转化为Th细胞和CTL。Th细胞在IL-2、IL-4和IFN-γ（自分泌）作用下,进一步扩增为Th1和Th2细胞。Th1通过维持CD8+T细胞增殖实现细胞免疫，Th2细胞通过B细胞作用实现体液免疫。该方式下，DNA疫苗同时诱发了细胞免疫和体液免疫，效果明显优于传统疫苗。Th1或Th2细胞增殖可通过改变免疫方式调节，肌肉注射时，一般诱导Th1型免疫反应（细胞免疫），皮内免疫时，一般诱导Th2型免疫反应（体液免疫）。这种全方位免疫诱发记忆性B细胞和T细胞形成，从而可有效预防疾病发生。

DNA疫苗的作用机制

▉ DNA疫苗的递送与应用

截止目前，尚未有DNA疫苗获批在人体内使用，主要是基因表达不充分和免疫系统活化效率低问题。为了解决该问题，研究人员在DNA序列设计、疫苗构建和递送模式方面进行了改进。递送方面，传统针刺递送方式可划分为皮内、皮下、静脉注射和肌肉注射。皮内注射似乎比皮下和肌肉注射效果更好，原因是真皮内存在大量树突状细胞（DC），可实现有效抗原提呈。静脉注射的优点则为可将DNA质粒递送至淋巴器官处APC，但该方式的效果是不确定的。此外,DNA疫苗还可通过粘膜递送，如口、鼻、肺等，诱导局部粘膜免疫和全身免疫。粘膜免疫被认为是抗病毒最有效的免疫方式，因为宿主感染起始阶段发生在粘膜表面。而且，粘膜免疫形式友好，不需要针刺、专业设备以及手术。

然而，裸DNA单独给药，由于存在体内稳定性、特定靶向、细胞摄取率和免疫系统调节缺陷，仍需通过电穿孔、微针或基因枪等特殊设备实现皮肤免疫。当然，这也可通过使用合适载体来改善，生物聚合物就是一个很好的选择。一般用作载体的物质包括脂质体、聚合物、病毒酶体、细胞穿透肽（CPPs）、活菌等。在这之中，聚合物具有理化稳定性高，低毒、有效保护力、易于制备、成本低特点。它比脂质体更刚性、更稳定，也不会带来病毒酶体和活菌导致的抗载体免疫。同时，聚合物可被设计成各种纳米结构，可调整大小与表面特性，对于药物载体应用很实用。对于DNA疫苗，生物学性质合成聚合物最佳，因其具有生物亲和性，易于细胞作用，生物降解，并能通过细菌或酶工程简单制备，应用前景广阔。

DNA疫苗的递送载体

▉ 总结与展望

迄今为止，DNA疫苗已被批准治疗兽用疾病，尽管尚未批准用于人类，但已有许多DNA疫苗应用于临床实验中。DNA疫苗目前仍存在一些挑战，如难以精准控制遗传物质及其本身较低的免疫原性，可通过研究基于生物聚合材料递送系统，以便提高其体内功效，最终应用于临床。

参考文献：

1.Franck CO, Fanslau L, Bistrovic Popov A, Tyagi P, Fruk L. Biopolymer-based Carriers for DNA Vaccine Design. Angew Chem Int Ed Engl. 2020 Sep 7. doi: 10.1002/anie.202010282. 

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