Nature Neuroscience：在用光遗传学吗？这个问题要注意了！
现在在神经科学界广泛使用的光遗传学技术，是通过在神经元上表达光敏感的视蛋白，然后酷炫地用光控制神经元的活动。实际上，Owen组的新研究表明【1】，打光到大脑中实际上可能会加热脑组织，在即使没有视蛋白的情况下也能对神经元活动以及动物的行为产生影响。
这个发现将如何影响在“光时代”下的实验设计呢？
光遗传学技术成功实现了科幻小说中描写的场景：把激光打入大脑。目前它已经成为神经科学实验室里的一个标准实验方法。研究人员可以利用光敏感的离子通道，病毒载体技术和转基因老鼠品系等等手段来任意切换神经元的开关，从而研究神经元对生物和行为上的影响。
但是当我们用光子对神经元“狂轰乱炸”，是不是会无意间对神经元会造成一些意料之外的影响？
Owen在Nature Neuroscience上发表的文章表明用光照背侧纹状体 (dorsal striatum)的中型多棘神经元(medium spiny neurons, MSNs)导致的对该脑区的加热抑制了神经元的活动从而影响了动物的运动行为。在使用持续光照时这种影响更大，而使用持续光照正是抑制性光遗传技术常用的手段。
在活体中使用光遗传控制神经元活动包括一系列的操控：病毒转染，蛋白表达，光纤埋置（会对目标脑区上方造成相应的损伤）。目前所有常用的对照组实验设计都是一组表达了附有荧光团的视蛋白的动物对照另一组仅仅表达了荧光团的动物。然而，在这些实验中，所有实验组都接受光照。
研究人员想要了解仅仅光照本身是否会影响神经元活动。事实上，这极有可能，很多的生命过程都被证实是温度敏感的。对脑组织产生热能效应的担忧在光遗传技术开始之初就被出现了，刺激了预估光热分布的模型的发展。可是，通过模型来预计影响神经元活动的光热的证据十分有限。关于可以解释这种效应的机制也没有得到很好的研究。
Owen通过在野生型小鼠背侧纹状体植入的光纤下再植入一个记录神经元活动的电极，通过比较中型多棘神经元在光刺激发放和不发放时的“点火率”，来研究光热效应。
神奇的是，即便是没有任何光遗传的结构体的表达，持续的光照也会抑制神经元的活动。同样的效应也可以在急性脑切片中被重复。在这两种情况下，神经元活动的下降与激光的强度显著相关。
无视蛋白表达的神经元接受光刺激【2】
为了验证这个假设，Owen测量了背侧纹状体植入的光纤下部的温度，他们发现光照引起的温度上升的时间进程和中型多棘神经元活动下降的时间进程一致。
在实验中，研究者通过膜片钳发现无须激光照射，而是直接控制脑片局部的温度，就可以激发中型多棘神经元的外向电流（outward current），并且中型多棘神经元活动的改变程度与温度变化成正比。
有趣的是，另一个类似的实验为发现这个神秘电流的离子通道提供了第一证据：将它的电流-电压关系画出后，发现其电生理特征非常类似一个内向整流的钾离子通道的电流-电压曲线。该电流会被铯基底（cesium-based）的内部溶液消除，更加证明了光照发放激发了钾离子电导。
另一些实验表明，光激发的电流出现在多种表达钾离子通道的神经元（纹状体，齿状回，皮层）类型中同时很少出现在无钾离子通道表达的一种神经元类型中（海马CA1区的锥形细胞）。
尽管未来还需要更多的工作来证实这些证据，Owen和他的同事们的研究结果支持了光激发引起的热能可以对内向整流钾离子通道进行调控从而抑制神经元活动。
尽管已经找到光热引起的电流的潜在“分子元凶”，Owen继续通过实验证明目前广泛应用的光遗传实验方案是否会影响动物行为。他们在一组野生型小鼠的背侧纹状体植入光纤，研究单侧光照对小鼠旷场（open field）运动行为的影响。惊奇的是，光照刺激的发放本身就足以使小鼠背离绕圈运动，这种影响与抑制中型多棘神经元的活动产生的效果一致。
尽管这项研究有很多重大的发现，仍存在一些机理相关的问题没有解答。例如，研究者们用来证实光照刺激引发的电流的来源是内向整流钾离子通道的证据不是一种直接的自然状态，未来仍需更多的实验来提供信息。
一种可能的方法是检验在基因敲除小鼠（缺失钾离子通道的某个或者某几个亚基的表达）中这种光照引发的电流是否消失。如果确是以上信息，其他钾离子通道可能引发光照电流的贡献不能被完全排除。此外，胶质细胞也表达内向整流钾离子通道，它们的生理特性也有可能被光照的释放所影响。
未来还需要更多的工作来描绘网络层面的对于突触可塑性的影响以及由于胶质细胞功能改变引起的神经递质从突触间隙清除的影响。Owen的工作为光照引发的温度改变调控钾离子电导从而无须视蛋白表达就可以改变神经元活动并对行为和生理产生影响提供了强有力的证据。
更实际的结果是我们在未来如何优化光遗传学的实验设计呢？
组织被加热去觉得很多光照激发的变量。通过利用计算机模型，Owen证实了热效应可以通过更短的脉冲发放时长、更低的激光能量、更长波长的光，以及频率更高的刺激发放来实现最小化。在这些变量中，脉冲发放时长和激光能量似乎是影响温度的最重要的元素。
如果脉冲发放时长不到100 ms, 高达30 mW的激光能量引起的温度变化仅为0.1 ℃，几乎可以忽略。
如果激光能量低到0.5 mW，脉冲时长长达20 min，的激光能量引起的温度变化仅为0.2℃，也几乎可以忽略。
因为大部分的光遗传刺激模式的脉冲时长都小于100 ms并且钙成像也通常使用毫瓦级别的光能，光照引发的热能问题大多数集中于发放持续光照刺激的光抑制的实验中。
下面，他们评估了一系列目前可以找到的光抑制的工具，来鉴别哪种视蛋白在减少光热效应的角度下最合适于光抑制实验。
抑制性视蛋白广泛的应用于引发临时性的特定“功能丧失”调控。氯泵（chloride pump）halorhodopsin（eNpHR3.0）【3】被广泛应用于光抑制实验并且被证实可以有效地被大约3 mW的黄光（波长509 nm）引发高达100 mV超极化。根据Owen的计算机模型数据，halorhodopsin可以使用长达1 s脉冲时长的抑制模式实现光热效应最小化。
Jaws是另一种抑制性工具，它也有类似的特征但是对红光更敏感，因为红光波长更长，因此有可能实现1s以上脉冲时长的光热效应最小化。
尽管不是很常用，光激发的阴离子通道GtACR1和GtACR2在光敏感性上比氯泵更有优势，0.1 mW以下的激光能量也能引起较大的电流。这使得GtACRs和SwiChR++（一种仅由短脉冲光照就可引发长时间的电流响应的双稳定阴离子通道）成为避免长时程光抑制对脑组织加热的有力工具。
光驱动的氯泵halorhodopsin的结构
可是，GtACRs、SwiChR++或者其他的阴离子通道（例如，iC++）对神经元活动的影响取决于局部区域氯离子的梯度。因此当逆转电位下氯离子的去极化，这些工具有可能矛盾地产生激发作用。
类似地，常用的质子泵ArchT展现了更优于halorhodopsin的光敏感性，但因为有报道称质子泵eArch3.0在抑制时会受pH值影响产生自发神经递质的释放，它的应用也很复杂。综合来看，halorhodopsin和Jaws还是在氯离子梯度未知的环路中光抑制的最有效的工具。
除了选择视蛋白，Owen提供的数据也为未来的实验设计提供了思路。例如，作者强烈支持加入另一组仅表达了荧光团并且不用激光刺激的对照组。光抑制实验包含光关闭的对照，特别是激光关-开-关的行为范式能够让我们更清楚的区分视蛋白或者光热效应对生理以及行为的影响。
如果无须精准时控，使用药物遗传学（仅由设计药物激发的设计受体，DREADD）抑制工具hM4Di，通过给予药物CNO来激发内向整流钾离子通道从而实现抑制功能，或者通过基因靶向表达神经毒素（例如TeNT）来永久性的使神经元静默。这些神经元抑制的其他选择和和急性光抑制相比都是在自然状态下的长期过程，会从不同方面引起网络动态的变化。然而，无论这些实验结果如何，这些补充方法都帮助证明了观察到的影响并非是光热效应引发的“假象”。
总的来说，该研究证明了光引发的组织被加热可能是很重要的元素，我们在抑制型光遗传学实验设计中需要提供对照组。
同近期相关的报道（非特定类型细胞表达的Cre小鼠系的生殖系重组，抑制型视蛋白的矛盾激发效应，在DREADD实验中用到的药物CNO的脱靶效应等）一起，Owen的工作为研究者提供了一个很重要的提醒：对于精细控制神经元活动的技术发展非常复杂，我们对于这些技术的使用也需要跟着一同复杂化。因此对技术相关的不可避免的警告和局限我们都要阐明和解释。
参考资料：
1.Owen, S. F., Liu, M. H. & Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nat Neurosci 22, 1061-1065, (2019).
2.Cardozo Pinto, D. F. & Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nat Neurosci 22, 1039-1041, (2019).
3.Kolbe, M., Besir, H., Essen, L. O. & Oesterhelt, D. Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 A resolution. Science 288, 1390-1396, (2000).
作者信息
编译作者：葱葱茫茫导（brainnews创作团队）
校审：Simon （brainnews编辑部）
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