Cell Reports争鸣：单核测序不适用于人类疾病中小胶质细胞的激活情况检测？！

神经胶质细胞是中枢神经系统数量最多的细胞类型，在脑的功能活动中发挥着重要的调节作用。近年来，神经胶质细胞的生理功能及其在脑疾病，尤其是精神疾病和脑肿瘤等方面的作用研究备受关注。为进一步推动神经胶质细胞的研究，促进相关研究领域的拓展和同行间的合作交流，中国神经科学学会神经胶质细胞分会将于2020年11月6-8日在重庆举办2020年学术年会暨“神经胶质细胞与疾病”前沿研讨会。欢迎广大从事神经胶质细胞及相关研究工作的基础和临床研究人员积极参加。

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留言：胶质细胞

会议将围绕星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞的生理病理功能前沿进展进行交流，探索新技术、新方法在胶质细胞研究中的应用。本次会议由中国神经科学学会神经胶质细胞分会主办，陆军军医大学和重庆市解剖学会等单位承办。

由于可以对冷冻组织样品进行转录组分析，单核测序（snRNA-seq）可作为单细胞测序（scRNA-seq）的另一种选择。然而，目前尚不清楚单核测序是否能够检测人体组织中的细胞状态。最新的研究发现，对人脑样本的单核测序分析并不能检测出阿尔茨海默病（AD）中一部分小胶质细胞激活标志物。

来自比利时的Thrupp等人在Cell Reports发布题为Single-Nucleus RNA-Seq Is Not Suitable for Detection of Microglial Activation Genes in Humans的研究论文，比较了从癫痫手术中四个患者的颞皮质活检组织中获得的小胶质细胞的单细胞和单核的RNA-Seq。作者分离出14823个全细胞用于单细胞RNA-Seq，并从冷冻切片中分离了3940个小胶质细胞核做单核RNA-Seq。发现尽管大多数基因在细胞和细胞核中显示出相似的相对丰度，但与来自细胞的测序结果相比，有一小部分（约1%）的基因在细胞核测序结果中缺失。

这群基因富含与小胶质细胞激活相关的基因，包括APOE、CST3、SPP1和CD74，且其中18%为先前确定的小胶质细胞疾病相关基因。鉴于单核测序检测多种激活基因的敏感性较低，研究者认为单核测序不适用于检测人类疾病中小胶质细胞的激活情况。

研究结果：

1、单核测序可反映出人类组织样本中的主要细胞类型，但不能显示出小胶质细胞的状态

图 S1: 人类组织样本的单核测序分群结果

研究者对来自四个受试者的颞叶样本进行流式分选，对富集后的小胶质细胞进行单细胞测序；对来自同样样本的组织进行单核测序，并对经PCA降维后的数据按细胞类型进行分群（图S1A、图S1B）。随后选取单核测序中的小胶质细胞群（图S1C），对两种结果进行对比，分析表明两种方法中细胞因子和巨噬细胞分群相同，而小胶质细胞亚群则不尽相同（图S1D-F）。

2、人类细胞核和细胞中的基因表达分析

图1：人类皮层样本中小胶质细胞与小胶质细胞核之间基因丰度的对比

图S2：人类皮层样本中单个小胶质细胞与单个小胶质细胞核之间基因丰度的对比

为比较小胶质细胞与小胶质细胞核中基因丰度的差异，研究者来自4个样品的数据进行了丰度差异分析，发现了两种情况间丰度具有差异的基因（图1A、图1B），以及只在细胞数据中出现的3248个基因和只在细胞核数据中出现的5068个基因。此外，也证明了不是由于样品差异（图S2A）、测序深度（图S2B）、细胞数量（图S2C）的影响，并且在其他8组已发表的单细胞-单核对比数据中也体现出了一致性（图1C）。

为探究这些丰度差异基因的功能富集情况，研究者对其进行了GSEA（基因集富集分析），并用+NES（标准化富集分数）代表细胞核内富集，-NES代表细胞核内缺失，并发现细胞中高丰度基因在细胞质RNA中明显富集（图2A）。

为了进一步研究这些差异基因的性质，研究者用GO（基因功能分类）特征再次进行了GSEA。研究者选取了具有最高NES和最低NES的各100个GO特征，并对相似的GO特征进行整合，重复了GSEA分析（图2B），观察到神经元和突触功能相关基因在细胞核高丰度的基因群中富集，怀疑是在离心过程中产生的突触碎片和环境RNA-mRNA造成的影响（图S2D）。

又由于这些基因虽然与细胞水平相比在细胞核中富集，但仍然显示出较低的丰度（图1A），故从数据集中删除这些基因，最终检测到238个（原始数据中有246个）在细胞中的丰度明显较低的基因（图S2E），此外，在细胞核中的丰度明显较低的基因数量没有变化。

3、人类单核测序数据中缺失在小鼠AD模型中可检测到的激活基因

图2：在细胞核中富集或缺失基因的功能分析

研究还发现细胞核中免疫相关基因的缺失（图2B），因此，研究者对小胶质细胞激活基因在细胞核中是否缺失进行了分析（图2C）。值得注意的是，研究发现与小鼠小胶质细胞激活相关的基因严重缺失：包括 DAM（疾病相关小胶质细胞）相关基因（图2C、图2D）和ARM（激活反应小胶质细胞）相关基因（图2C、图2E），证实与整体细胞相比，小鼠小胶质细胞激活基因在细胞核中丰度较低。

此外，小鼠脂多糖（LPS）刺激上调相关基因也在细胞核中缺失（图2C，图S2F）。研究者还发现较短的基因在细胞核缺失基因中富集，进一步探究了激活相关基因是否也相对较短。经GSEA发现激活相关基因并非因GC含量而富集，但它们往往比一般基因群短（图S2G）。

4、人类单核测序数据中缺失在人类AD研究中发现的激活基因

接下来，研究者检测了在最近由Mathys等人进行的单核测序研究中被鉴定为AD中人类小胶质细胞反应的标志基因（图2C、图2F、图2G），这些反应标志物（Mic1）所得NES评分为-2.14，表明它们在细胞核中缺失（图2C）。此外，研究结果也表明，相对于细胞核，DAM基因和其它Mic1标志物在细胞中的丰度更高。

5、与先前研究的对比

与单峰细胞相比，双峰细胞更有可能在波纹中放电（图2C）；与正向回放相比，双峰细胞显示出参与反向回放更高的可能性（图2D），说明反向θ序列和反向回放之间的神经元联系。

图S3：与先前研究结果的对比

与本研究的结果相比，最近Gerrits等人对人类小胶质细胞的单核测序和单细胞测序的比较研究发现细胞核和细胞之间的基因丰度差别不大。研究者利用Gerrits等人的原始数据，对冷冻细胞核进行聚类（图S3A）和分型（图S3B），并经对比发现，新鲜细胞核与新鲜细胞的标准化丰度之间的差异很小（图S3C），然而当利用冷冻细胞核与新鲜细胞进行比较时，研究者再次观察到相同“核内缺失基因”在冷冻细胞核中表现出较低的相对丰度（图S3D）。

小编说：由于神经细胞的特殊性，单细胞测序有比较大的挑战。这篇研究发现尽管大多数基因在细胞和细胞核中显示出相似的相对丰度，但与来自细胞的测序结果相比，有一小部分（约1%）的基因在细胞核测序结果中缺失。那么，未来对于人类小胶质细胞的研究，该如何选择更好的研究手段？这篇研究只有4例样本，是否足够有说服力？在AD患者的研究中是否也会出现类似的结果？欢迎留言区或者加群讨论。

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参考文献：

Thrupp N, Sala Frigerio C, Wolfs L, Skene NG, Fattorelli N, Poovathingal S, Fourne Y, Matthews PM, Theys T, Mancuso R, de Strooper B, Fiers M. Single-Nucleus RNA-Seq Is Not Suitable for Detection of Microglial Activation Genes in Humans. Cell Rep. 2020 Sep 29;32(13):108189. doi: 10.1016/j.celrep.2020.108189. PMID: 32997994; PMCID: PMC7527779.

作者信息

 

编译作者：Joanna（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）

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