Neuron再报道：氯胺酮抗抑郁症的作用机理
氯胺酮（ketamine）,是一种谷氨酸N-甲基-D(NMDA)受体阻断剂,能产生快速而持续的抗抑郁药的反应，是近60年治疗难治性抑郁症领域重要药物。氯胺酮可有效治疗患者自杀意念，其抗抑郁作用已在许多人类和动物研究中得到证实。尽管这些临床和临床前发现令人鼓舞，但关于氯胺酮治疗重度抑郁症(MDD)的疗效仍存在争。这促进了对氯胺酮作用机制的研究，以便开发更好的抑郁症治疗干预措施。
图1 氯胺酮治疗抑郁症
（图源：抑郁症 氯胺酮的搜索结果_360图片 (so.com)）
2022年5月31日，德国马克斯·普朗克精神病学研究所和压力神经生物学和神经遗传学学系Alon Chen研究组在Neuron 上发表文章“Ketamine exerts its sustained antidepressant effects via cell-type-specific regulation of Kcnq2 ”，文章我们发现Kcnq2基因是氯胺酮在海马腹侧谷氨酸能神经元中作用的重要下游调节剂。
通过一系列分子、电生理、细胞、药理、行为和功能实验来验证这些发现。研究人员证明，KCNQ激活剂瑞加滨的辅助治疗可增强氯胺酮在小鼠中的抗抑郁作用。有趣的是，这些效应是氯胺酮特有的，因为它们不能调节对经典抗抑郁药(如艾司西酞普兰)的反应。这些发现显著地促进了对氯胺酮持续抗抑郁作用机制的理解，具有重要的临床意义。
图2 氯胺酮通过细胞特异性调控Kcnq2调控持续的抗抑郁效果
（图源：Juan Pablo Lopez, et al.Neuron 2022.）
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为了描述与氯胺酮持续抗抑郁作用相关的细胞类型特异性分子变化，研究人员用氯胺酮或生理盐水对照组治疗小鼠。治疗后2天收集大脑，制备单细胞悬液用于scRNA-seq，聚类分析显示了13个具有不同GE特征的细胞簇。
随后，进行了差异表达分析，以评估氯胺酮作用的细胞类型特异性分子特征。在13个集群中的7个中总共鉴定了263个差异表达基因(DEGs)，发现263个DEGs中有31个在多于1个集群中显著失调;然而，135个DEGs仅存在于谷氨酸能(GLUT)神经元中，27个存在于星形胶质细胞中，16个存在于少突胶质细胞中，3个存在于少突胶质细胞祖细胞(OPCs)中，1个存在于内皮细胞中，1个存在于血管细胞中。
此外，使用Enrichment对三种具有最大DEGs的细胞类型进行了途径富集分析。在GLUT神经元中，揭示了许多重要的通路涉及钙信号、突触功能和可塑性以及神经发育障碍。星形胶质细胞富集脂肪酸伸长、缝隙连接、吞噬体活性和阿尔茨海默病，而少突胶质细胞富集维生素消化、吸收和脂肪酸伸长。
GLUT神经元是最有趣的细胞类型，基于其多基因反应(165个DEGs)及其在调节氯胺酮抗抑郁作用中的已知作用。研究人员从scRNA-seq分析中选择了8个GLUT神经元中最高的DEGs(4个上调，4个下调)。发现，在tdTomato+细胞中量化的大部分基因都明显失调，并且与我们的scRNA-seq发现方向一致。电压门控钾通道Q家族成员2 (Kcnq2)在氯胺酮治疗后表现出最强的作用。
图3 单细胞鉴定GLUT神经元中高表达Kcnq2基因
（图源：Juan Pablo Lopez, et al.Neuron 2022.）
氯胺酮治疗调节原发性海马神经元中的Kcnq2。接下来研究人员检查了氯胺酮对初级海马神经元的单独处理是否可以调节之前测试的8个基因的mRNA表达。小鼠初级海马神经元主要由GLUT神经元组成，因此是一个非常好的模型系统，可以进一步验证之前的体内研究结果。
原代神经元培养21 d后，用单剂量氯胺酮(10 μM)或其活性代谢物(2R, 6R)-羟氯胺酮(HNK) (10 μM)刺激原代神经元。处理后，在2、12、24或48 h收集神经元，并与未处理和生理盐水对照组进行比较。发现，与未处理的初级神经元相比，盐水处理后检测的8个基因中的任何一个的表达都没有显著差异。
然而，发现氯胺酮治疗后8个基因中有7个的mRNA表达发生了显著变化，这与我们的scRNA-seq发现方向一致。在DEGs中，治疗后Kcnq2的GE变化最大，在所有时间点均表现出显著上调。研究结果表明，Kcnq2受氯胺酮的转录调控，可能是vHipp谷氨酸能神经元中氯胺酮作用的重要下游调节剂。
图4通过FACS验证单细胞RNA-seq数据
（图源：Juan Pablo Lopez, et al.Neuron 2022.）
氯胺酮可增加体外和体内海马神经元中KCNQ通道电流。Kcnq2基因编码Kv7.2蛋白，这是一种作用缓慢、电压门控的钾通道，在神经元兴奋性的调节中起着关键作用。Kv7.2和Kv7.3蛋白(Kcnq3基因)可形成KCNQ(Kv7)均四聚体或异四聚体，产生标志性的m电流，调节神经元的整体兴奋性。
为了研究KCNQ通道作为氯胺酮持续抗抑郁作用的中介，研究人员用HNK (10 μM)或生理盐水对照组处理小鼠原发性海马神经元24小时，并使用全细胞电压钳记录来量化m-电流密度(IM)。与盐水处理的对照组相比，HNK处理的神经元IM电流密度显著增加。
接下来，对急性海马切片进行了离体膜片钳记录，以测试氯胺酮治疗对IM电流密度的影响。简单地说，给小鼠注射氯胺酮或生理盐水，两天后处死。电生理记录专门取自vHipp的谷氨酸(CA1锥体)神经元。与的体外研究结果类似，氯胺酮处理的小鼠与盐水处理的对照组相比，IM电流密度显著增加，表明氯胺酮增加了体内KCNQ通道的表达。
这些结果表明，氯胺酮治疗后2天，谷氨酸神经元中Kcnq2 mRNA表达增加，同时海马体中GLUT神经元中功能性KCNQ通道表达显著增加。
总之，研究人员的发现进一步支持了KCNQ通道是氯胺酮持续作用的下游调节剂的观点，并表明vHipp的GLUT神经元中这些通道的调节可能是MDD治疗的潜在靶点。
图5 氯胺酮与HNK刺激的体外和离体效应
（图源：Juan Pablo Lopez, et al.Neuron 2022.）
vHipp中Kcnq2的shRNA敲除降低了氯胺酮的抗抑郁作用。M通道(KCNQ)是由Kcnq2和Kcnq3基因编码的蛋白质形成的，它们都是完整膜蛋白。在原始队列、FACS排序的样本中，研究人员没有发现氯胺酮治疗后Kcnq3 mRNA表达的任何显著差异，或在初级海马神经元中，表明氯胺酮对Kcnq2有特异性作用，而对Kcnq3没有特异性作用。
为了探索Kcnq2和Kcnq3在大脑中的表达，研究人员检查了公开的原位杂交(ISH)数据，这些数据来自小鼠大脑的12个不同区域。Kcnq2在海马区表达最高，而Kcnq3在多个脑区表达最高。此外，单细胞数据以及其他公开的单细胞数据集显示，Kcnq2只在神经元中表达，而Kncq3在神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和OPCs中表达。
这些发现强化了Kcnq2在海马体神经元中发挥重要和更集中的作用的观点，使该区域成为体内病毒操作的良好候选者。为了从功能上探讨Kcnq2在介导氯胺酮抗抑郁作用中的作用，研究人员设计了腺相关病毒(AAV)构建体来在体内敲除Kcnq2。
转染Neuro2a(N2a)培养的细胞并将病毒注射到成年小鼠的vHipp中，可导致体外和体内Kcnq2 mRNA水平显著降低。研究人员将shRNA-Kcnq2或shRNA-scramble对照aav双侧注射到一个新队列的vHipp中。
4周后病毒注入,一半的老鼠被随机选择接受氯胺酮或生理盐水注入,和氯胺酮的抗抑郁效果评估使用强迫游泳测试,验证测试评价抗抑郁疗效在啮齿动物。在shrna混乱对照处理的小鼠组中，发现与对照组相比，氯胺酮处理的小鼠在FST期间静止时间显著减。
值得注意的是，在表达shRNA-Kcnq2病毒的小鼠中不再检测到氯胺酮的抗抑郁作用。评估了运动活动，以排除氯胺酮治疗后FST中运动过度的任何混淆效应，并发现组间总活动没有差异。
这些结果表明vHipp是Kcnq2功能和氯胺酮持续抗抑郁作用的重要位点。
图6 体内操作小鼠海马腹侧Kcnq2调节抗抑郁类行为
（图源：Juan Pablo Lopez, et al.Neuron 2022.）
KCNQ的药理作用可调节小鼠的抗抑郁类行为。此前对啮齿动物的研究表明，KCNQ功能可以通过高度特异性的激动剂和拮抗剂进行调节。为了进一步探索KCNQ通路作为氯胺酮潜在的治疗靶点，研究人员研究了KCNQ单独或联合氯胺酮对行为是否有影响。小鼠接受了两种药物组合注射。
首先用XE991(一种有效且选择性的KCNQ (Kcnq2/3)通道抑制剂)治疗小，使用不同浓度，在不使用或联合使用氯胺酮的情况下，并与盐水处理的对照组进行比较。为了评估氯胺酮、XE991及其组合对小鼠行为的影响，将这些小鼠暴露于FST。
正如预期的那样，发现与盐水处理的小鼠相比，氯胺酮处理的小鼠在FST期间静止时间显著减少。没有发现将XE991与生理盐水结合使用的小鼠有任何显著差异，这表明单独使用XE991不会在FST中产生任何急性行为影响氯胺酮的抗抑郁作用在同时使用XE991和氯胺酮治疗的小鼠中被消。
这些结果表明，KCNQ活性可能是氯胺酮发挥其抗抑郁作用的必要条件。然后，试图测试是否可以使用选择性KCNQ(Kcnq2/3)通道激活剂瑞加滨来模拟、增加或放大氯胺酮的作用。
与之前的实验一样，小鼠被盐水、氯胺酮或氯胺酮与两种不同浓度的瑞加滨联合处理。我们再次观察到，与生理盐水对照相比，氯胺酮在FST中具有显著的效果。没有发现瑞加滨单独与生理盐水联合使用时的任何影。然而，与氯胺酮联合使用时，雷加滨(1 mg/kg)在FST中产生了更强的效果，与单独使用氯胺酮相比有显著差异。
有趣的是，氯胺酮和瑞格滨以更高的剂联合给药在FST中没有产生任何急性行为影响。这与氯胺酮的倒u型剂量反应是一致的。这些结果表明，KCNQ的药理作用调节了抗抑郁类药物的行为。
图7 KCNQ的药理作用可调节小鼠的抗抑郁类行为
（图源：Juan Pablo Lopez, et al.Neuron 2022.）
综上所述，研究人员发现单次亚麻醉剂量氯胺酮可产生快速和持续的抗抑郁反应，是精神病学最重要的突破之一，但对此的分子机制仍不清楚。本研究的研究描述了氯胺酮持续作用的一种未知的细胞类型特异性分子机制，并为重度抑郁症的治疗提供了新的策略。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627322004093
参考文献
Juan Pablo Lopez, Malte D. Lücken, Elena Brivio, Stoyo Karamihalev, Aron Kos, Carlo De Donno, Asaf Benjamin, Huanqing Yang, Alec L.W. Dick, Rainer Stoffel, Cornelia Flachskamm, Andrea Ressle, Simone Roeh, Rosa-Eva Huettl, Andrea Parl, Carola Eggert, Bozidar Novak, Yu Yan, Karin Yeoh, Maria Holzapfel, Barbara Hauger, Daniela Harbich, Bianca Schmid, Rossella Di Giaimo, Christoph W. Turck, Mathias V. Schmidt, Jan M. Deussing, Matthias Eder, Julien Dine, Fabian J. Theis, Alon Chen, Ketamine exerts its sustained antidepressant effects via cell-type-specific regulation of Kcnq2,Neuron,2022,ISSN 0896-6273
编译作者：Dr.Hu（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）