新型冠状病毒标本实验室检测及生物安全处理程序

2020年2月4日，河南省卫生厅临床检验中心、郑州大学第一附属医院检验科发布了《新型冠状病毒标本实验室检测及生物安全处理程序》，供大家学习借鉴。

一、病原生物学特性

新型冠状病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（Bat~SL~CoVZC45）同源性达85%以上。目前已经获得该病毒的全基因组序列、电镜照片，体外分离培养已经成功。

二、流行病学特点

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1、传染源

目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。无症状感染者也可能成为传染源。

呼吸道标本（鼻咽拭子、咳痰、抽吸痰、肺支气管肺泡灌洗液、防污染毛刷、组织等）含有病毒，有传染性。部分患者，尤其是危重型患者，会有病毒血症。病毒血症时的血液标本，有传染性。部分患者有腹泻症状，尚未证实腹泻患者粪便标本的传染性，建议按有传染性处理。胸腔积液少见，尚未证实胸腔积液标本的传染性，建议按有传染性处理。

尚无病毒载量信息的标本：尿液、胸腔积液之外的其他正常无菌体液（脑脊液、心包积液、腹腔积液、后穹隆穿刺液、关节液）、腹膜透出液、精液、女性生殖道分泌物等，建议目前按有传染性处理。

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2、传播途径

经呼吸道飞沫和接触传播是主要的传播途径。

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3、易感人群

人群普遍易感。

三、临床特点

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1、临床表现

基于目前的流行病学调查，潜伏期1~14天，多为3~7天。 

以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。

轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。 

从目前收治的病例情况看，多数患者预后良好，少数患者病情危重。老年人和有慢性基础疾病者预后较差。儿童病例症状相对较轻。 

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2、实验室检查

发病早期外周血白细胞总数正常或减低，淋巴细胞计数减少，部分患者可出现肝酶、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酶和肌红蛋白增高；部分危重者可见肌钙蛋白增高。多数患者C反应蛋白（CRP）和血沉升高，降钙素原正常。严重者D-D二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少。

在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸。 

四、个人防护

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1、分级防护

• 一级生物安全防护：医用外科口罩、乳胶手套、工作服、医用防护帽，加手卫生。

• 二级生物安全防护：医用防护口罩或N95口罩、乳胶手套、工作服外隔离衣、医用防护帽，加手卫生。

• 三级生物安全防护：医用防护口罩或N95口罩、双层乳胶手套、面屏、护目镜、工作服外防护服、双层医用防护帽，加手卫生。必要时双层口罩（外医用防护口罩，内N95）。

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2、穿戴防护用品顺序：

七步洗手→ 戴医用防护口罩 → 戴一次性工作帽 → 戴一次性医用手套（内层） → 穿一次性医用防护服 → 穿防水鞋（靴）套 → 戴一次性医用手套（外层）→ 戴护目镜和/或防护面屏。

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3、脱卸防护用品顺序：

评估个人防护用品污染情况 → 消毒或更换外层手套 → 脱护目镜和/或防护面屏 → 脱外层手套 → 七步洗手 → 脱一次性医用防护服、防水鞋（靴）套 → 脱一次性工作帽 → 七步洗手 → 脱医用防护口罩 → 脱内层手套 → 七步洗手 → 换回个人衣物。

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4、注意事项

手套佩戴前需进行气密性检查，戴手套不能替代手卫生；外科口罩佩戴时双手沿鼻沿压紧贴合；所有口罩戴上后进行气密性检查，摘下时不要碰触正面；防护服覆盖内层工作服；防护服袖口覆盖内层手套袖口，外层手套覆盖防护服袖口；脱除防护服时注意内裹外原则，污染面切勿接触内部衣物；及时使用速干型手消剂进行手卫生并严格执行七步洗手法。

五、标本采集

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1、采集对象

新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、确诊患者复查、发热门诊患者及其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，标本采集应在发热门诊或隔离病房进行。

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2、防护要求

从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训和具备相应的实验技能，并采用生物安全三级实验室级别的个人防护（详见第四条）。

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3、标本采集种类

每个病例必须采集急性期呼吸道标本和急性期血液标本；重症病例优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液等），可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。

• 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽吸物。

• 下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼吸道标本）。

• 血液标本：尽量采集发病后7天内的急性期抗凝血。采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液。

• 血清标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3~4周采集。采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用真空采血管。血清标本主要用于抗体的测定，从血清抗体水平对病例的感染状况进行确认。血清标本不进行核酸检测。

• 眼结膜标本：出现眼部感染症状的病例需要采集眼结膜拭子标本。

• 粪便标本：出现腹泻症状的患者需采集便标本。

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4、标本采集方法

• 咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml 病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

• 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

• 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。

• 深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml采样液的50ml螺口塑料管中。

• 支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来代替收集）。

• 肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30-50 ml，总量100-250ml，不应超过300ml。

• 血液标本：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液标本5ml，室温静置30min，1500-2000rpm离心10min。

• 血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30min，1500-2000rpm离心10min。

• 粪便标本：如患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便标本3~5ml。

• 眼结膜拭子标本：眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，将拭子头插入采样管中，尾部弃去，旋紧管盖。

六、标本运输

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1、院内运输

• 包装：标本采集后用1000mg/L含氯消毒液对标本容器外表面进行擦拭或喷洒消毒，然后放入带有生物安全警示标识的专用标本自封袋中包装，并对自封袋外表面用1000mg/L含氯消毒液进行消毒，然后置于专用密闭转运箱，并对转运箱外表面用1000mg/L含氯消毒液消毒。

• 运送：由经过生物安全培训的专人运送至实验室，运送人员应佩戴帽子、一次性外科口罩、手套、隔离衣，转运期间保持转运箱平稳，避免剧烈震荡、颠簸。

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2、院外运输

应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部令第45号）要求执行。依据国家《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》，新型冠状病毒毒株及其他潜在感染性材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装材料应符合PI602分类包装要求。

七、标本接收

实验室接收人员用1000mg/L含氯消毒液对转运箱消毒后方可打开，再用1000mg/L含氯消毒液对自封袋进行消毒，自封袋在生物安全柜内打开，取出标本，详细核对标本信息，做好交接登记。

八、标本检测

个人防护应采用生物安全三级实验室防护级别。

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（一）常规检测项目：

血常规、肝功能、心肌酶、LDH、肌钙蛋白、肌红蛋白、CRP、PCT、肾功能、电解质、D-D二聚体、血气分析、血沉等项目。

1、血常规、血沉等不开盖标本操作后直立放置。

2、生化、免疫、凝血等开盖标本的处理

2.1 标本的离心需在通风橱内进行，离心后静置15min方可打开离心机盖。

注意：离心机要用具有密封盖的转头，严防离心管意外破碎形成气溶胶。

2.2 标本的开盖要在生物安全柜内操作。

注意：生物安全柜需要有CMA资质的第三方检测机构出具的检测合格证明，每次开机要用烟雾法或丝线检测操作口的气流方向；试验前用75%酒精对生物安全柜进行擦拭消毒（禁止喷洒），作用30min后，紫外线消毒30~60min，生物安全柜风机运行至少5min后方可开始操作；操作结束后风机运行5min，用75%酒精对生物安全柜进行擦拭消毒（禁止喷洒），作用30min后，紫外线消毒30-60min，方可关机。

2.3 专机专用检测，在上机操作时应避免溢洒，检测结束后及时加盖封闭。

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（二）核酸检测

1、实验室资质：

同时具备以下三个条件：三级甲等医院；根据《病原微生物实验室生物安全管理条例(国务院第424号令)，具备在设区的市级人民政府卫生健康主管部门备案的生物安全二级及以上实验室；根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法(卫办医政发[2010]194号)，具备经过省级卫生健康行政部门审核备案的临床基因扩增检验实验室。

2、人员资质：实验操作人员具有PCR上岗证，并经过严格的生物安全防护培训。

3、检测流程

标本的离心在通风橱内进行，开盖、取样、核酸提取等操作均在生物安全柜内进行。

按试剂盒说明书编写试剂准备、核酸提取、扩增检测、结果分析及报告等的标准操作程序，并严格遵照执行。参与检测提取的内参添加于实验的全过程，设置阳性质控、阴性质控（详见4.3）。

4、质量控制及结果报告

4.1 实验试剂、设备：使用到的核酸提取试剂、荧光PCR检测试剂、全自动核酸提取仪、一体化检测系统、荧光定量PCR仪均需取得医疗器械注册证。

4.2 标本类型：检测的标本类型需符合试剂说明书中的标本要求。

4.3 质量控制：建议每批检测设立一个弱阳性质控、三个阴性质控，三个阴性质控随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，三个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。

4.4 结果报告：检验结果严格按照试剂说明书要求判读。在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，如口咽等部位的呼吸道样本；样本采集的过早或过晚；样本保存、运输和处理不正确；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。

九、实验室环境消毒

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（一）抵抗力

对新型冠状病毒理化特性的认识多来自对 SARSr-CoV 和MERSr-CoV 的研究。病毒对紫外线和热敏感，56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。氯己定不能有效灭活病毒。

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（二）空气消毒

实验室配备充足的空气消毒机或紫外线灯，每天试验前后常规消毒（空气消毒机1h/次，紫外线灯30-60min/次）。

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（三）物表消毒

1、每天试验前后使用1000mg/L有效氯的消毒液进行桌面、台面及地面消毒。

2、 所用门把手、电话等公共设施每天使用1000mg/L有效氯的消毒液消毒3次（有个案报道，门把手2019-nCoV核酸检测呈阳性）。

3、 每天用1000mg/L的含氯消毒液对医疗废物暂存间地面进行消毒2次。

4、 医疗废物运送结束后，用1000mg/L的含氯消毒液对运送工具进行清洁和消毒。

5、 每天试验前后用75%酒精对生物安全柜进行擦拭消毒，禁止喷洒（详见八（一）2.2）。

6、转运及存放标本的容器使用前后用1000mg/L的含氯消毒液进行擦拭消毒。

十、医疗废物处置

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（一） 废弃物处置：

1、医疗废物专用包装袋、利器盒的外表面应当有警示标识，在盛装医疗废物前，应当进行认真检查，确保其无破损、无渗漏。医疗废物收集桶应为带盖脚踏式。每个包装袋、利器盒应当系有或粘贴中文标签，标签内容包括：医疗废物产生单位、产生部门、产生日期、类别，并在特别说明中标注“新型冠状病毒感染的肺炎”。

2、医疗废物分类收集。咽拭子等呼吸道标本检测后置于含有5500mg/L含氯消毒液的容器中，其他感染性废物弃置于带有双层黄色医疗垃圾袋的专用医疗垃圾桶，3/4满时双层黄色医疗垃圾袋鹅颈包扎后，用1000mg/L含氯消毒液喷洒医疗垃圾袋表面，实验过程中如使用锐器(包括针头、小刀、金属和玻片等)直接弃置于锐器盒内，以上所有医疗废物经压力蒸汽灭菌处理后方可离开实验室。压力蒸汽灭菌效果需监测并记录。

3、严格对压力蒸汽灭菌处理后的医疗废物进行登记。登记内容包括医疗废物的来源、种类、重量或者数量、交接时间，最终去向以及经办人签名，特别注明“新型冠状病毒感染的肺炎”或“新冠”，登记资料保存3年。

4、应当由经过适当培训的人员使用适当的个人防护装备和设备处理危险废弃物。

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（二）废液处理

标本检测后产生的废液，用含5500mg/L的有效氯消毒液彻底灭活后，倒入医院污水处理通道。

十一、意外事故处理

（一）新型冠状病毒毒株或其它潜在感染性材料污染生物安全柜的操作台造成局限感染：使用含5500mg/L的有效氯消毒液，消毒液需要现用现配，24小时内使用。

（二）含病毒培养皿碎裂或倾覆造成实验室污染：保持实验室空间密闭，避免污染物扩散，使用含5500mg/L的有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区。必要时（大量溢洒时）可用过氧乙酸加热熏蒸实验室，剂量为2g/m³，熏蒸过夜；或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m³，作用1~2h；或用高锰酸钾-甲醛熏蒸：高锰酸钾8g/m³，放入耐热耐腐蚀容器（陶罐或玻璃容器），然后加入甲醛（40%）10ml/m³，熏蒸4h以上。熏蒸时室内湿度60%~80%。

（三）清理污染物严格遵循病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

【参考文献】

1、《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》2、《国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒感染的肺炎防控方案（第三版）》（国卫办疾控函[2020]80号）3、《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》（国卫办科教函[2020]70号)4、《国家卫生健康委办公厅关于做好新型冠状病毒感染的肺炎有关医疗工作的通知》（国办医函[2020]92号）5、《关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国卫办医函[2020]53号）6、《国家卫生健康委办公厅关于做好新型冠状病毒感染的肺炎疫情期间医疗机构医疗废物管理工作的通知》（国卫办医函[2020]81号）7、《河南省卫生健康2020委关于修订河南省人间传染的病原微生物实验室生物安全事件应急预案的通知》（豫卫科教[2020]1号 ）8、《河南省卫生健康委关于印发医疗机构内新型冠状病毒感染预防与控制相关流程的通知》（豫卫医﹝2020﹞2号）9、《关于新型冠状病毒感染的肺炎防控工作中生物样本运输等有关问题的通知》（豫卫科教函[2020]3号）10、《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）11、《医疗废物管理条例》中华人民共和国国务院令（第380号）12、《医疗卫生机构医疗废物管理办法》中华人民共和国卫生部令第36号13、《医疗废物分类目录》（卫生部和国家环境保护总局）14、国家环境《消毒技术规范》（卫法监发[2002]282号）15、《医疗废物专用包装物、容器标准和警示标识规定》（保护总局[2003]188号）

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