超全荧光定量PCR应用常见问题汇总！
常见的荧光定量PCR
问题解答
实时荧光定量技术是什么
20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术（Real-time qPCR），其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。荧光定量PCR最大的优势可以对初始模板进行定量，目前已广泛应用于生命科学、医学研究等领域。
小编辛苦总结荧光定量PCR常见问题打包给各位 ，现整理如下，请大家批评指正。
常见问题罗列
没有CT值
实验结果一旦遇到没有Ct值情况，就要在第一时间排查是否有以下问题：
（1）循环数不够（但是一般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准）；
（2）PCR程序设置不对，检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中；
（3）引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；
（4）模板量可能降解或上样量不足（但一般不超过500ng，根据试剂盒说明书即可），对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；如果发生模板降解，应考虑样品准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样品小量分装储备，避免反复冻融；
（5）引物探针是否合适（尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增）。
CT值过晚
在相对定量中，Ct值一般控制在15~25之间比较好，如果在绝对定量中，对低拷贝数的样品，Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计和目的进行。
（2）PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短（可以在推荐的时间条件下延长10s）；
（3）MgCl2浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；
（4）PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；
（5）模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
标准曲线线性关系不佳
如果遇到标准曲线线性关系不佳R2<0.9）的情况，那么很有可能是以下环节存在问题：
（1）标准品稀释或者加样存在误差，吸样不准，使得标准品不呈梯度；
（2）标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装，保存于-20℃或-80℃，不要反复冻融，现配现用；
（3）引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；
（4）模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量不超过500ng，以50~500ng为宜。
阴性对照扩增有信号
如果阴性对照扩增有信号，首先排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：
（1）引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
（2）引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
（3）镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。
（4）模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。
（5）交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
熔解曲线峰不特异
如果熔解曲线峰不特异，那么很有可能是以下环节存在问题：
（1）引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现，这是最主要因素；引物浓度不佳，尤其是涉及二聚体存在时，适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度比例；
（2）离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒，不同试剂盒在该方面的优化能力不适合，有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果；
（3）模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。
扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因，特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时，应考虑如下情况：
（1）反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解；
（2）反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法，适当延长变性退火时间；
（3）反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的，应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。
扩增曲线的异常
如果遇到扩增曲线异常，比如“S”型曲线等等情况，那么很有可能是以下环节存在问题：
（2）荧光染料的降解；
（3）在操作荧光定量PCR时，带上新的一次性手套，盖上避免任何指纹或者字迹等；
（4）液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发，没有很好的聚集在管子里；
（5）气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。
参考文献：
Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits （EUROGENTEC）