rVSV-ZEBOV疫苗无血清生产：一次性使用固定床生物反应器 vs 微载体搅拌罐
摘要
埃博拉病毒病(EVD)是一种致命性疾病，近年来偶发于非洲大陆，并导致严重的疫情。rVSV-ZEBOV是一种重组水泡口炎病毒结构，其中的天然病毒糖蛋白替换为埃博拉病毒(Zaire)糖蛋白。免疫被认为是预防这种高传染性疾病最有效的方法。所以，迫切需要开发经济高效且可放大的疫苗生产工艺，以使疫苗可大规模使用。贴壁细胞被广泛用于疫苗的开发和商品化生产。由于生物工艺行业近来的发展，对病毒性疫苗有很大的需求，超过了当前的生产能力。但是，使用传统技术(如搅拌罐、静态细胞培养)进行病毒疫苗的生产会有一定的局限性，如有限的可放大性、灵活性以及较高的生产成本。Univercells Technologies开发了一种可规模放大的新型固定床生物反应器，可帮助以可负担的形式，为市场提供所需数量的疫苗产品。在本研究中，将rVSV-ZEBOV的Vero细胞无血清生产工艺从微载体搅拌罐生物反应器转移到了Univercells Technologies的scale-X™固定床生物反应器。我们证实，固定床生物反应器培养可获得均匀的细胞分布，以及感染性病毒颗粒更高的细胞特异性产率。此外，将细胞培养工艺从搅拌罐生物反应器成功转移到固定床生物反应器，可较低设备占地，并实现更具成本效益的生产。
1. scale-X™一次性使用固定床生物反应器
图1: scale-X™ hydro 生物反应器是一款低占地、高面积生物反应器，其使用一次性使用、可高压灭菌的管路和预组装的流道，实现可放大性、自动化以及细胞采样。
图2: scale-X™生物反应器范围
2. 工艺设置
细胞系 & 病毒: 贴壁Vero细胞系源于 ATCC CCL-81.5 & 使用病毒为VSV-ZEBOV。
实验# 1: 比较微载体和固定床中的Vero细胞生长，并评估固定床中的细胞均质性。
STR中的微载体培养: 生物反应器培养在1L生物反应器内进行(Applikon Biotechnology)。生物反应器中的微载体浓度为2 g/L。使用VP-SFM+ 4mM L-谷氨酰胺培养基，并添加 0.1%泊洛沙姆199。接种密度22,700 cells/cm2，工作体积850 mL。
scale-X™ hydro 生物反应器培养: 生物反应器培养在2.4m2 hydro 生物反应器中进行。使用VP-SFM+ 4mM L-谷氨酰胺培养基。接种液工作体积700mL，密度约为11,458 cells/cm2。循环使用2L体积，以10mL/min的流速进行。
实验# 2: 评估固定床vs微载体中的VSV-ZEBOV生产。细胞以与微载体生物反应器(22,727 cells/cm2 ) 相似的细胞密度接种固定床(22,708 cells/cm2 ) ，生物工艺以相同的方式进行，工艺参数维持为相同的设定点。在相同的3天细胞培养时间后，以MOI 0.01，感染rVSV-ZEBOV。
3. 结构化固定床中均匀的Vero细胞生长
微载体生物反应器和scale-X™ hydro固定床生物反应器中的Vero细胞生长相当。不同的细胞接种浓度导致了略有偏移但相当的生长趋势。scale-X™生物反应器中的单位面积细胞浓度(2.7x 105 cells/cm2 )稍高于微载体培养(2.4 x105 cells/cm2 )(图4)。主要代谢底物浓度数据显示，两种系统中具有相似的生物动力学。
图4: scale-X™ hydro生物反应器和标准微载体培养中的Vero细胞生长
图5: 固定床细胞支撑层中的Vero细胞分布
4. 病毒产量
在34°C 时，微载体生物工艺中的细胞密度在感染后不再继续增加，但在固定床生物反应器中，感染后的第一个24小时内，细胞密度没有出现同样的急剧下降 (图6 & 7)。感染后24小时，达到最高感染性滴度1.95×107 TCID50/mL，说明，由于相比微载体系统，细胞被更紧实地填充在固定床中，从而可能可使病毒在该空间内更容易地贴附到细胞，所以获得了更快的反应动力学。此外，在感染后的前4小时，固定床单元和培养基瓶之间的培养液循环暂停。相比微载体生物反应器，在该段时间内，病毒的单位体积浓度可提高2.8倍。
图6: 在1L生物反应器中的Vero细胞生长和rVSV-ZEBOV生产，病毒生产阶段温度降低至34 °C。
图7: 在scale-X™ hydro 固定床生物反应器中的Vero细胞生长和rVSV-ZEBOV生产，病毒生产阶段温度降低34 °C。
此外，相比微载体工艺中生产峰值时1130 VG/TCID50 的病毒基因组和感染性滴度比例，固定床生物反应器中仅为101 VG/TCID50，说明其生产的病毒质量更好，从最高细胞密度看，固定床生物反应器生产峰值时，可获得 14.4 TCID50/cell和1459 VG/cell的比例。这表示相比微载体系统，固定床生物反应器中感染性颗粒的细胞特异性产率可提高1.9倍。该工艺可进一步优化，以证实scale-X™平台的可放大性。
5. 结论
scale-X™ hydro固定床生物反应器可生产与微载体运行相似的感染性滴度，但达到的生产时间更短。此外，固定床生物反应器生产rVSV-ZEBOV的病毒基因组和感染性滴度比例更低，而感染性病毒颗粒的细胞特异性产率更高。总体结果显示，当工艺转移至固定床scale-X™生物反应器时，可获得相似的细胞生长趋势和最高单位面积细胞浓度。最后，对Vero细胞生长分布的研究显示，固定床内有均匀的细胞贴附和生长。相比微载体工艺，固定床的紧凑设计可使设备占地降低5倍。结果同时显示，结构化scale-X™固定床生物反应器不仅是替代传统“规模扩展”技术的合适方式，如多层培养皿和滚甁，也可替代技术上更具挑战性的培养系统，如微载体工艺。
原文翻译：S,Kiesslich, J.P.V.Losa, J.G´ elinas, et al., Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells: microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology, 2020, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.01.015.
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