慢病毒基因治疗的规模化生产
本文节选自《Scalable Manufacturing of Lentiviral Gene Therapies》，详细内容，请参考原文。
溶酶体贮积病（Lysosomal storage diseases）是由表达缺陷性溶酶体蛋白的突变基因所引起的。例如，胱氨酸病是一种由编码胱氨酸蛋白的缺陷性基因所导致的代谢性疾病。
Avrobio开发了用于治疗溶酶体贮积病的基因治疗方案。2019年10月8日，该公司宣布了第一位接受AVR-RD-04研究型基因治疗方案的患者，项目对患者自身的造血干细胞进行基因修饰，以治疗胱氨酸病。该公司同时还在法布里（Fabry）病和戈谢（Gaucher）病上开展了临床阶段项目，这两者皆为溶酶体贮积病。
Avrobio的技术平台包括用于生产基因治疗药物的自动化、封闭式系统工艺。在原文中，Kim Warren（Avrobio运营主管）介绍了慢病毒在基因治疗中的使用，并突出介绍了该公司柏拉图（Plato）平台的应用。
为什么使用慢病毒载体？
许多溶酶体贮积病已经被很好地了解，对于其中的一些疾病，可采用酶替代疗法（ERT）。但是，ERT不能从根本上解决这些疾病，因其不能完全替代正常功能的酶。由于ERT在血液中的半衰期很短，酶活性在给药后会激增，然后快速下降接近零。因此，患者需要多次输液。例如，一名法布里病患者每隔一周就需要接受ERT输液。
即使接受了ERT疗法，许多溶酶体贮积病患者还是面临寿命显著缩短的状况。ERT可帮助缓解相关的症状，但是多数患者仍然存在严重的、未被满足的需求，包括主要器官和肌肉的退化、中枢神经系统的并发症以及整体生活质量的下降。
慢病毒载体是最常使用的体外基因治疗，其被设计用于将稳定且持久整合的转基因递送至患者的造血干细胞。该过程以从患者收获CD34+干细胞开始。收获的细胞使用慢病毒载体进行修饰，插入转基因，以生产功能性蛋白质，如特定的酶。修饰的干细胞回输至患者体内，其将进入患者的骨髓。细胞分裂产生子细胞，并全部携带用于此类细胞所需的功能性蛋白质表达所需的转基因。在某些情况下，蛋白质分泌，以帮助其它有缺陷性基因的细胞，这个过程被称为“交叉校正”（cross-correction）。
Avrobio希望利用体外慢病毒基因治疗工艺，在患者的身体和大脑中递送一致的、系统性的稳定酶活性，以期使溶酶体贮积病患者受益，临床试验的候选人已在研究当中。
工艺开发
一旦患者筛选并进入临床试验后，其将接受已经广泛建立的药物治疗方案，使造血祖细胞和干细胞从骨髓释放到血液中。细胞单采收集，从患者获得的单采单元被送至Avrobio的区域生产基地进行细胞处理。单采单元袋放置在使用一次性使用可抛弃型管路套件进行操作的设备中。第一天，使用包被了抗CD34抗体的磁珠，从单采单元富集造血细胞。CD34+细胞表面标记物识别造血祖细胞，包括干细胞。然后，将这些细胞置于培养舱，加入生长因子，孵育过夜。这是“启动步骤”，第二天，在准备就绪的细胞中加入载体。载体将把疾病特异性人体转基因的正确版本插入到CD34+细胞，再孵育过夜。之后收获细胞，储存袋低温保存，并运回临床站点。
慢病毒生产过程
细胞产品的制备需要几天的时间，但是有些工作可以在药物产品生产之前或之后进行。载体设计针对每个项目进行，生产载体的质粒也必须相应生产。Avrobio使用平台化的工艺进行针对不同适应症的载体的制备。工艺以四质粒系统开始，这可带来更高的安全水平。对于公司目前的适应症，四质粒中的三个是相同的，而第四个携带针对特定适应症的转基因。公司相信，保持四个质粒中的三个相同，有利于实现工艺的可放大性和经济效益。
质粒供应给载体生产商，其在悬浮培养的人胚胎肾（HEK）239T细胞中生产载体。在悬浮培养中进行载体生产是为了提高可放大性和经济效益，同时，使用无血清的化学限定培养基，其可提高安全性和一致性。如有需要，生产可规模放大至200L。针对每个适应症的载体批量生产，然后运输至药物产物生产工厂，进行患者细胞的修饰。
药物产品低温保存后，Avrobio进行所有的出厂检测，约需要45-60天。放行后，药物产品被运输到临床站点。这时，患者回到诊所，接受使用最先进的精准剂量进行的个体化调节，以准备骨髓移植和静脉输注药物产品。当其可移植后，患者自身经基因修饰的细胞返回到骨髓。在试验的治疗后随访期间，对患者血液和其它组织的生物标记物进行监测，如酶活水平、底物降低以及是否存在转基因。
产品稳定性
低温保存为患者和医疗机构提供了一些便利。可以对产品进行全面的检测，并可根据患者的日程安排进行临床随访。低温保存的细胞非常稳定，其类似于其它用于自体干细胞移植的产品，后者通常使用相同的工艺 – 尽管此类细胞不进行基因修饰。预计运输不会有太高的挑战性，可以使用液氮温度来保存药物产品。通过良好的日程安排，患者不会感到不便，患者和生产商可以配对，而不影响产品质量。
使用从患者新鲜单采的单元进行药物产品的生产至关重要。这是Avrobio建设区域化生产网络的主要驱动力。公司目前的临床工艺使用Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy系统，这是一种自动化的封闭系统，有利于提高安全性和细胞质量。
工艺自动化可提高可重复性，有助于进行药物-产品生产操作员的培训。由于公司有三个站点，所以这一点就显得特别重要。使用封闭式系统，有可能在单个洁净室内处理多个单元 – 甚至在相同的洁净室内进行针对不同适应症的工艺 – 而且只要建立合适的控制策略，还可在更低级别的洁净室内进行生产。
用于其它适应症的平台工艺
Avrobio已经开发了其柏拉图平台工艺，以便简单地将方案转移到其它罕见病适应症上来。该方案建立在公司之前针对其它适应症的工作之上。系统从质粒开始，其中3/4与其它适应症相同。载体使用相同的工艺制备，所以制备针对每一个适应症的药物产品的工艺基本相同。唯一的区别是，特定的适应症需使用特定的载体。针对特定适应症的出厂检测会有差别，如效价，但是大部分是相同的。Avrobio相信，对于不同的适应症，监管路径应该相当相似。
原文：M.Rios, K. Warren, Scalable Manufacturing of Lentiviral Gene Therapies. BioProcess Internnational, 2020, 18（3）：16 - 19.
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